Eletrorretinograma Análise da Visual Response no peixe-zebra Larvas

O objetivo geral deste procedimento é ilustrar as etapas necessárias para realizar análises eletrográficas em larvas de peixe-zebra. Isso é feito gerando primeiro as micropipetas de vidro de formato e tamanho apropriados. O segundo passo é configurar cuidadosamente o equipamento crítico para o experimento, como eletrodos de referência e registro.

Em seguida, a larva de peixe-zebra é anestesiada e devidamente orientada em relação ao equipamento de estimulação e registro. A etapa final é a colocação adequada do microeletrodo de vidro na córnea da larva do peixe-zebra. Em última análise, larvas de peixe-zebra.

A análise ERG é útil para investigar a função visual do cone na retina de todos os vertebrados do cone in vivo. Este método é muito útil para responder a questões-chave no campo da ciência da visão, como a identificação de vias de sinalização que contribuem para a sensibilidade visual e adaptação à luz em cones. A demonstração visual deste método é crítica, pois o posicionamento adequado do microeletrodo de registro na amostra é difícil de aprender devido ao pequeno tamanho do olho da larva do peixe-zebra.

Para iniciar este procedimento, puxe várias micropipetas usando capilares de vidro de boro silicato polido com filamento. Verifique cada micropipeta sob um microscópio com uma régua de graduação apropriada para garantir que o diâmetro das pontas seja de 10 a 15 micrômetros e até mesmo na aparência. Crie uma solução de trabalho no dia do experimento diluindo 10 x solução de ringer para um x.

Com o filtro de água destilada deionizada, esterilize a solução para garantir que as partículas não bloqueiem a ponta da micropipeta. Em seguida, oxigenado com 95% de oxigênio, 5% de dióxido de carbono por 10 minutos. Tampe bem a solução depois para garantir que a solução permaneça oxigenada.

Agora coloque uma plataforma de plástico móvel com um fundo de absorção de choque de polímero de uretano viscoelástico na mesa antivibração sob a fonte de luz. Em seguida, posicione a câmera com um suporte magnetizado e aponte-a para a plataforma de plástico móvel. Em seguida, posicione o micro manipulador do microeletrodo de gravação em um segundo suporte magnetizado.

Certifique-se de que a câmera e o micromanipulador não sejam perturbados pelo movimento de outros equipamentos e não bloqueiem a iluminação da fonte de luz. Depois, conecte a câmera a um monitor de vídeo e posicione-a em direção à plataforma. Certifique-se de que a configuração esteja devidamente aterrada com fio de cobre.

Nesta etapa, corte um pequeno retângulo de esponja PVA seca que se encaixará perfeitamente em uma placa de Petri de 35 milímetros com uma lâmina de barbear limpa. Faça um corte adicional na esponja para acomodar o eletrodo de referência. Em seguida, use um marcador resistente a produtos químicos para marcar um pequeno ponto na esponja onde a larva será colocada.

Depois disso, mergulhe a esponja de PVA em solução de campainha até saturar. Remova e seque-o rapidamente em uma toalha de papel duas a três vezes antes de colocá-lo em uma placa de Petri limpa de 35 milímetros. Em seguida, posicione a placa de Petri contendo a esponja em uma plataforma de plástico de forma que a marca possa ser visualizada pela câmera.

Em seguida, clore os eletrodos mergulhando-os em seis a 9% de cloreto de sódio. Em seguida, seque-os ao ar em um lenço Kim por cinco minutos. Coloque o pellet de prata e cloreto de prata do eletrodo de referência dentro ou sob a esponja, dependendo do estilo do corte feito, e conecte o cabo do eletrodo de referência ao sistema de gravação.

Em seguida, conecte aproximadamente 40 centímetros de tubo a uma seringa de cinco mililitros sem isca e encha a seringa com solução de campainha. Depois, encha uma seringa de bloqueio sem isca de um mililitro com solução de campainha. Usando um microfill, encha cuidadosamente o suporte do microeletrodo e evite a formação de bolhas.

Em seguida, conecte a seringa de cinco mililitros à porta de pressão do suporte do microeletrodo com tubulação usando o microenchimento e uma seringa de mililitro cheia de solução de campainha. Encha a micropipeta de vidro a partir da ponta e certifique-se de que não há bolhas. Em seguida, conecte a micropipeta de vidro ao suporte do microeletrodo e tome cuidado para manter o fio do eletrodo reto.

Uma vez fixado, use a seringa de cinco mililitros para forçar cuidadosamente a solução de campainha através do microeletrodo até que uma pequena quantidade de solução seja visível na ponta. Agora coloque cuidadosamente o microeletrodo de gravação no micromanipulador e conecte o cabo ao sistema de gravação para verificar se há ruído no sistema. Coloque o eletrodo de referência e a ponta do microeletrodo de registro em uma placa de Petri de 35 milímetros cheia de solução de ringer.

Verifique os níveis de ruído elétrico da configuração com um osciloscópio ou um recurso integrado do aparelho ERG. Os níveis de ruído não devem ser superiores a mais ou menos 10 microvolts da linha de base. Neste procedimento, corte vários quadrados de papel toalha de um centímetro quadrado, anestesiar três a cinco larvas em uma placa de Petri de 35 milímetros, adicionando trica a uma concentração final de 0,02% e esperando de um a dois minutos.

Depois disso, transfira cuidadosamente uma larva individual para um quadrado de papel toalha sob um estereoscópio de dissecação com iluminação mínima. Verifique a posição das larvas escolhendo um candidato com o lado dorsal para cima com o olho ocluído para sessões de gravação que duram mais de 30 minutos. Mantenha a larva úmida envidraçando o corpo com 3% de metilcelulose usando uma escova fina de pêlo de camelo.

Em seguida, transfira o quadrado de papel toalha com a larva para a esponja PVA úmida. Em seguida, aplique um fluxo contínuo de oxigênio a 100% saturado de água sobre as larvas, borbulhando o gás através de uma pedra de ar em um frasco de arma contendo água destilada. Posicione o oxigênio umidificado da arma do frasco perto da cabeça das larvas com um tubo sob iluminação mínima.

Use o micromanipulador e a câmera para posicionar a ponta do microeletrodo no ponto médio entre as extremidades nasal e do olho e pressione suavemente o limite dorsal da córnea. Deixe as larvas se adaptarem ao escuro por cinco a 10 minutos. Em seguida, registre as respostas do flash de teste à luz fornecida por uma fonte de luz LED ou estimulador óptico.

Esta figura mostra uma gravação típica de ERG em um peixe-zebra de cinco larvas DPF. Os peixes adaptados ao escuro foram expostos à luz LED branca por 20 milissegundos com intensidades variando de uma a 5.000 cânulas por metro quadrado com o início do estímulo luminoso em zero segundos. O potencial negativo de uma onda é difícil de distinguir, enquanto o potencial positivo da onda B é o pico dominante da forma de onda.

Esta inserção mostra as amplitudes médias de resposta da onda B que foram ajustadas usando a equação apressada NACA. Esta figura mostra uma gravação típica de ERG em um peixe-zebra de cinco larvas de DPF adaptado ao escuro tratado com um PB. Os peixes são expostos à luz branca LED por 20 milissegundos com intensidades que variam de uma a 5.000 cânulas por metro quadrado, e o potencial receptor de massa do cone isolado é o elemento dominante da forma de onda. Esta inserção mostra as amplitudes médias de resposta de um peixe-zebra larval tratado com PB que foi ajustado usando a equação apressada NACA.

Esta figura mostra uma gravação típica de ERG em cinco larvas de peixe-zebra tratadas com D-P-F-A-P-B. Usando um paradigma de flash duplo. Os peixes adaptados ao escuro são expostos a sucessivos 20 milissegundos de luz branca.

O LED pisca com uma intensidade de 1000 cânulas por metro quadrado, e o ISI entre os flashes é de dois segundos. O início de cada estímulo luminoso é indicado aqui. Esta figura mostra a razão entre a resposta potencial máxima do receptor de massa de cone isolado do segundo estímulo e a do estímulo inicial com o aumento do ISI, o que indica a recuperação progressiva da sensibilidade dos fotorreceptores.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a qualidade das gravações é ditada pela integridade da conexão da córnea do eletrodo e pela saúde das larvas. O desenvolvimento desta técnica aumentou muito a capacidade dos pesquisadores das ciências da visão de explorar a adaptação e recuperação do cone na retina dos vertebrados in vivo.