זיהוי סימולטני של הפעלת ג-Fos מאתרים זכו דופמין Mesolimbic ו Mesocortical בעקבות סוכר נאיבי בליעת שומן אצל חולדות
24 באוגוסט 2016
מטרת מחקר זה היא לזהות רשתות מוח מופצות הקשורות גמול על ידי התוויית טכניקת immunohistological אמינה באמצעות הפעלת C-FOS הסלולר למדוד לשינוים סימולטניים מסלולי דופאמין ואתרי מסוף לאחר בליעת רומן של שומן וסוכר בחולדות.
המטרה הכוללת של פרוטוקול ניסיוני זה היא לקבוע האם ה-VTA, ואזורי ההקרנה הדופמינרגים (DA) המזו-טלו-אנצפליים העיקריים שלו, יציגו הפעלת c-Fos מתואמת וסימולטנית לאחר צריכה ראשונית של תמיסות שמן תירס, גלוקוז, פרוקטוז או סכרין. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הנוירוביולוגיה, כגון מוטיבציה, ולזהות האם מספר אתרים במוח מופעלים באופן מתואם בתגובה לגירויים מעוררי תיאבון. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא משלבת מבחנים התנהגותיים מבוססים, טכניקות להפעלת תאים וניתוחים סטטיסטיים.
להכנת המערך, השתמשו במבחנה לצנטריפוגה מכוילת עם פקק גומי, ובצינורית שאיבה ממתכת בזווית של 45 מעלות כדי לספק מדידה מדויקת של התמיסה המוצגת לחולדה. הצמידו את המערכת לכלוב המגורים באמצעות קפיץ מתכת מתוח, ובאופן המאפשר נראות של הכיול. שלושה עד חמישה ימים לפני האימון, הגבילו את מנות המזון של החולדה כדי להפחית את משקל גופה ל-85% ממשקלה המקורי, וזאת כדי להגביר את המוטיבציה לצריכת התמיסה.
בינתיים, ספק לבעל החיים 10 milliliters של תמיסת אימון מוקדם, המכילה 0.2% saccharine, במשך ארבעה ימים, במפגש של שעה אחת, כדי למקסם את ההסתברות שהחולדה תטעם את תמיסת הבדיקה הבאה בלטנציה קצרה. שקול את המבחנה לפני ואחרי כל מפגש כדי לקבל את מדד הצריכה. לאחר מכן, בצע בדיקת צריכה ביום החמישי על תתי-קבוצות המקבלות את אחת משש התמיסות.
יש לוודא שלתמיסת הדגימה של החולדות יש זמן תגובה קצר (short latency), ולהוציא את הנבדקים מהמחקר אם דרישה זו אינה מתמלאת. להכנת הרקמה, לאחר הקטלת בעל החיים, הוצא את המוח מהגולגולת במהירות. השתמש בקוצצי עצם (rongeurs) כדי לסדוק בזהירות ולהסיר את העצם מהמוח, מהחלק האחורי קדימה.
עבדו באזור שמתחת למוח הקטן, וודאו שהקוצצים (rongeurs) נמצאים בין העצם לבין הקרום העכבישי (meningeal pia mater). לאחר הסרת החלק העליון ודפנות הגולגולת, השתמשו במרית קטנה כדי להרים את המוח מבסיסו, וגזרו את העצבים הגולגולתיים בעזרת מספריים קטנים. לאחר מכן, קבעו את המוח בתמיסת 4% paraformaldehyde למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.
ביום למחרת, הניחו את המוח בתמיסת הסוכרוז בטמפרטורת החדר, עד ששקע לתחתית המכל. לאחר מכן, הסירו את הבצל האופולקטורי (olfactory bulb). בהמשך, הסירו את המוחון ואת הגשר (pons).
לאחר מכן, קבעו את המוח במישור קורונלי, כאשר החלק הקודאלי מקובע למסכת המיקרוטום, וחתכו נתחים קורונליים בעובי 40 mirometers. בהליך זה, טפלו בנתחים בחמישה מיליליטר של 5%normal goat serum ו-0.2%Triton x-100 ב-PBS, למשך שעה אחת. לאחר מכן, דגרו את הנתחים המטופלים עם נוגדן ראשוני בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 36 שעות, בבארים המכילות מיליליטר אחד של PBS.
לאחר 36 שעות, שטפו את הSections שלוש פעמים עם 5 milliliters של PBS למשך 10 דקות בכל פעם. לאחר מכן, דגרו את הSections עם secondary antibody בטמפרטורת החדר למשך שעתיים, בבארים המכילות 1 milliliter של PBS. לאחר מכן, שטפו את הSections שלוש פעמים ב-5 milliliters של PBS למשך 10 דקות בכל פעם.
בשלב הבא, דגרו את החתכים השטופים למשך שעתיים בתערובת Avidin horseradish peroxidase זמינה מסחרית. לאחר שעתיים, שטפו את החתכים שלוש פעמים ב-5 mL של PBS, למשך עשר דקות בכל פעם. לאחר מכן, הגיבו את החתכים עם DAB בנוכחות מי חמצן, למשך חמש עד עשר דקות.
לאחר מכן, בצעו סימון כפול של חיתוכי ה-VTA על ידי דגירה שלהם עם נוגדן לטירוזין הידרוקסילאז, בחמישה מיליליטרים של PBS, למשך לילה בטמפרטורה של 4°C. למחרת, שטפו את החיתוכים שלוש פעמים בחמישה מיליליטרים של PBS, למשך עשר דקות בכל פעם. לאחר מכן, דגרו את החיתוכים עם נוגדן משני בחמישה מיליליטרים של PBS, בטמפרטורת החדר, למשך שעתיים.
לאחר שעתיים, שטפו את החתכים שלוש פעמים בחמישה מיליליטר של PBS, למשך עשר דקות בכל פעם. כדי להנמיח את הנוגדן באמצעות קומפלקס פראוקסידאז של נוגדן משני, הגיבו אותו עם שילוב של DAB ותמיסת ניקל סולפט בריכוז 0.3%, למשך חמש עד עשר דקות. ספרו את התאים על ידי לחיצה כפולה על סמל התוכנה.
עברו לשורת התפריטים, לחצו על Acquisition ולאחר מכן על Live Image. לאחר מכן, התאימו את המיקוד לאזור העניין (region of interest) ולחצו על המסך כדי לקבוע נקודת ייחוס. בשלב הבא, עברו לסורת כלי הרשת, ולחצו על Display Grid ועל Use Grid Labels.
סמנו את אזור העניין באמצעות קו מתאר שנקבע מראש. לאחר מכן, ספרו את כל התאים בכל אזור עניין, ובחרו ב-Plus בסרגל הצד השמאלי כדי לרשום את ספירות תאי ה-c-Fos. הגדירו תא כחיובי ל-c-Fos כאשר נצפה עיגול אדום-כהה מוגדר.
חזור על תהליך זה עבור כל אתר, והבטח כי המהימנות הבין-שופטת של שני השופטים הבלתי-מיודעים עבור כל חלק בכל אזור עניין עולה תמיד על 0.8. לאחר מכן, ספור את הנוירונים החיוביים ל-c-Fos באזורי העניין. קבע האם תגובה אימונוהיסטוכימית ל-c-Fos קיימת בתאים החיוביים ל-TH ובתאים השליליים ל-TH ב-VTA.
תמונה זו מראה כי צריכת שומן או סוכר מגבירה באופן דיפרנציאלי את השפעול של c-Fos באמיגדלה כולה, וכן בתתי-אזורים בסיסו-לטרליים ובמרכזי-קורטיקו-מדיאליים של האמיגדלה. בתמונה זו, נצפה שפעול ממשי של c-Fos באמיגדלה בבעלי חיים שנחשפו לצריכה של שמן תירס, גלוקוז וכן פרוקטוז. שפעול של c-Fos ב-VTA נצפה גם בבעלי חיים שנחשפו לשמן תירס ומים.
חצים שחורים מצביעים על תאי TH c-Fos חיוביים בעלי סימון כפול מייצגים, בעוד שחצים אפורים מצביעים על תאי c-Fos בלבד מייצגים. לאחר השליטה בשיטה, ניתן להשלים אותה תוך שלושה עד ארבעה שבועות, במידה והיא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להקפיד על מתודולוגיה, אחסון וספירה מדויקים.
תודה שצפיתם, ובהצלחה בניסוייכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה נועד לזהות רשתות מוחיות הקשורות לתגמול באמצעות שימוש בטכניקה אימונוהיסטולוגית למדידת הפעלה של c-fos במסלולי דופמין לאחר בליעה של שומן וסוכר בחולדות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- מדעי ההתנהגות
- נוירוביולוגיה
רקע
- הבנת תפקידו של הדופמין בעיבוד תגמול.
- חקירת ההשפעות של גירויים טעימים על הפעלת המוח.
- שימוש ב-c-fos כסמן להפעלה נוירונלית.
- בחינת הקשר בין תזונה למוטיבציה בחולדות.
מטרת המחקר
- לקביעת הפעלת c-fos ב-VTA ובאזורי ההקרנה שלו.
- להערכת ההפעלה המתואמת של מספר אתרים במוח.
- לבדיקת ההשפעות של תמיסות סוכר ושומן שונות על הפעילות המוחית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בדיקות התנהגותיות להערכת מוטיבציה.
- טכניקות אימונוהיסטולוגיות למדידת הש activates של c-fos.
- ניתוחים סטטיסטיים להערכת דפוסי הפעלה של המוח.
- הכנת תמיסות לצריכה על ידי חולדות.
תוצאות עיקריות
- הפעלת c-fos סימולטנית שנצפתה בתגובה לצריכת מזון חדש.
- זיהוי דפוסי הפעלה נבדלים במסלולי דופמין.
- ראיות להפעלה מתואמת של אתרים מוחיים בתגובה לגירויים טעימים.
- מוטיבציה מוגברת המהווה קורלציה לצריכת מזון לאחר הגבלה במשקל.
מסקנות
- המחקר מספק תובנות לגבי המנגנונים הנוירוביולוגיים של תגמול.
- הממצאים עשויים להנחות מחקרים עתידיים על מוטיבציה והשפעות תזונתיות.
- שילוב של טכניקות התנהגותיות ותאיות משפר את ההבנה של תפקודי המוח.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
זיהוי סימולטני של הפעלת c-Fos לאורך המסלולים הדופמינרגיים המזולמביים והמזוקורטיקליים מאפשר מיפוי מדויק של תגובות עצביות מפוזרות לצריכת רכיבים תזונתיים מעוררי תיאבון. גישה זו מחזקת את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות למנגנונים נוירוביולוגיים הקשורים לתגמול, ובכך תומכת בהפחתת סיכונים בשלבים מוקדמים של גילוי תרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS). קריאות כמותיות ממספר אתרים בשיטה זו מקלות על מיון יעיל של פורטפוליו ומבטיחות המשכיות תרגומית עבור תוכניות מחקר נוירופסיכיאטריות ומטבוליות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של הפעלה עצבית מתואמת בתגובה לגירויי תזונה מוגדרים.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי הבהרת המעורבות התפקודית של מסלולי דופמין.
- מספק ראיות כמותיות למעורבות של רשת מפוזרת בעיבוד תגמול.
- מסייע בביסוס ביטחון חיזוי לגבי היפותזות מנגנוניות עבור מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS).
סריקה ופיתוח בדיקה
- מקיים פרופילי הפעלה מתוקתקים של אזורי מוח לצורך סריקת תרכובות בהמשך התהליך.
- מספק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור של תגובה חיסונית ל-c-Fos במספר אתרים.
- תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה ובהשוואתיות בין מחקרים עבור נקודות קצה של הפעלה עצבית.
- מאפשר הערכה מהימנה של התערבויות מועמדות על מעגלי תגמול.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מקשר דפוסי הפעלה עצבית עם פנוטיפים התנהגותיים רלוונטיים למחלה במודלים של מכרסמים.
- מספק רצף ממיפוי מסלולים בשלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS).
- מסייע בקבלת החלטות מותאמות סיכון לגבי קידום אינדיקציות נוירופסיכיאטריות ומטבוליות.
- מחזק אסטרטגיות של ביומרקרים טרנסלציונליים על ידי קישור הפעלה תאית לתוצאות פונקציונליות.
שילוב זרימת עבודה ומסלול עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף שבין השלב הגילוי לשלב הפרה-קלניקה על ידי אפשור מיפוי של הפעלה עצבית המונחה-השערה, ובכך היא תומכת הן בתיקוף מטרות והן בפיתוח סמנים ביולוגיים תרגומיים.
- ביולוגיה של הגילוי: מכמת הפעלה מתואמת של c-Fos כדי להבהיר את מעורבות המסלול ולהפחית סיכונים בהשערות מנגנוניות.
- סריקה: מספק מדדי הפעלה סטנדרטיים וניתנים לשחזור לצורך פיתוח בדיקות והערכת תרכובות.
- אנליזה: מספק ספירות תאים כמותיות ומדדי מהימנות בין בוחנים להשוואה סטטיסטית חסונה.
- מחקר תרגומי: מקשר בין חתימות של הפעלה עצבית לפנוטיפים התנהגותיים, ובכך תומך בהתאמה של סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה ניתנת להרחבה ולשימוש חוזר למיפוי תגובות עצביות מפוזרות במודלים ובהתערבויות מגוונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS).
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של בדיקות הפעלה עצבית מרובות-אתרים לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת של המשך או הפסקה (go/no-go) וניהול פורטפוליו יעיל מבחינת הון.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים ובקידום תוכניות למחלות מטבוליות ולמערכת העצבים המרכזית (CNS).
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בנורו-אנטומיה, אימונוהיסטוכימיה וניתוח תמונות כמותי.
- מחייב גישה למיכשור התנהגותי מכויל, למיקרוטומים ולתוכנות דימיג.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדרית בין בוחנים והערכת מהימנות עבור ספירת תאים.
- ניתן להתאמה למודלים שונים של מכרסמים ולגירויים תזונתיים שונים באמצעות אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- תלוי בטיפול מדויק ברקמה ובתיקוף של הנוגדנים כדי להשיג תוצאות הניתנות לשחזור.
שאלות נפוצות בתחום הביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Title
0:54
Testing Apparatus and Intake Procedures
2:06
Tissue Preparation
3:22
c-fos Staining Procedure
5:29
Determination of c-fos Immunoreactive Counts
6:45
Results: Actual Amygdala and Ventral Tegmental Area c-fox Activation Following Fats and Sugars
7:35
Conclusion
