Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

This content is Free Access.

Hebrew
 
Click here for the English version

גנוטיפינג SNP

Overview

פולימורפיזם נוקלאוטיד יחיד, או SNPs, הם הצורה הנפוצה ביותר של וריאציה גנטית בבני אדם. הבדלים אלה בבסיסים בודדים ב- DNA לעתים קרובות אינם משפיעים ישירות על ביטוי הגנים, אך במקרים רבים עדיין יכולים להיות שימושיים לאיתור גנים הקשורים למחלות או לאבחון חולים. מתודולוגיות רבות הוקמו כדי לזהות, או "גנוטיפ", SNPs.

ההיכרות של JoVE עם SNP Genotyping מתחילה בדיון על מה הם SNPs וכיצד ניתן להשתמש בהם לזיהוי גנים הקשורים למחלות. לאחר מכן נבחנות מספר שיטות נפוצות של הגנוטפינג SNP, כולל הכלאה ישירה, שיטות מבוססות PCR, ניתוח קטעים ורצף. לבסוף, אנו מציגים מספר דוגמאות לאופן שבו טכניקות אלה מיושמות במחקר גנטי כיום.

Procedure

שונות גנטית מתרחשת הן בתוך ובין אוכלוסיות שונות, והיא תורמת לשינוי בתכונות, כולל רגישות למחלות, בקרב אנשים. הווריאציות הנפוצות ביותר הן פולימורפיזם נוקלאוטיד יחיד, או SNPs. genotyping SNP כרוך בקביעת קבוצות ספציפיות של וריאנטים, במקרה זה SNPs, נוכח בנפרד.

וידאו זה ידון בכמה מהעקרונות מאחורי genotyping SNP, לתת מבוא למספר שיטות זיהוי SNP נפוצות, ולבסוף, כמה יישומים של טכניקות אלה.

ראשית, בואו לדון מה SNP הוא וכיצד ניתן להשתמש בו genotyping.

"פולימורפיזם" הם אללים, או גרסאות שונות של לוקוס גנטי, שנמצאים בתדר ניכר באוכלוסייה, וכוללים תחליפי בסיס כמו גם כניסות או מחיקות. פולימורפיזם נוקלאוטיד יחיד הוא וריאציות בבסיס דנ"א אחד. SNPs יכול להתרחש בכל הגנום, ורובם אינם משנים את מבנה החלבון או ביטוי הגנים. עם זאת, הם עדיין עשויים להיות קשורים למחלות בשל הקרבה הפיזית שלהם, או "הצמדה", לגרסה גנטית הגורמת למחלה. מצד שני, ישנם מספר SNPs בולטים הידועים כגורמים ישירות למחלות כגון סיסטיק פיברוזיס, אנמיה חרמשית, β-תלסמיה.

יישום מעשי אחד עבור genotyping SNP הוא רפואה מותאמת אישית, שבו זיהוי של SNPs הקשורים למחלות, או עם תגובות דיפרנציאליות לתרופה או טיפול, עשוי לעזור לרופאים לאבחן טוב יותר ולטפל בחולים.

SNPs שימושיים גם למחקרי אסוציאציות כלל-גנומיים, הבוחנים מאות אלפי SNPs ברחבי הגנום כולו כדי לזהות אלה הקשורים לתכונות או מחלות. GWAS מנצל קבוצות של SNPs המכונה "haplotypes". SNPs בתוך ההפלוטיפ נמצאים "הצמדה disequilibrium", כלומר שילוב מסוים של וריאנטים נוטים יותר להתרחש יחד מהצפוי במקרה, לעתים קרובות תוצאה של הקרבה הפיזית שלהם על כרומוזום. משמעות הדבר היא כי haplotypes ניתן להבדיל על ידי genotyping רק מספר קטן של SNPs בודדים, מה שהופך את מחקרי האגודה הגנטית פחות עלות - או עבודה אינטנסיבית.

לאחר שבדקנו מה הם SNPs וכיצד ניתן להשתמש בהם, בואו נעבור על כמה מהמתודולוגיות הרבות שפותחו ל- SNPs של genotype. אלה כוללים הכלאה ישירה, שיטות מבוססות PCR, ניתוח קטעים ורצף.

טכניקות הכלאה ישירה כמו מערכי SNP משתמשות בבדיקות אוליגונוקלאוטיד קצרות כדי לזהות SNPs בודדים ישירות. מאות אלפי SNPs ניתן לבדוק על ביו-שבב אחד. הבדיקות קבועות כימית למטריצת השבבים, בדרך כלל מגלשת זכוכית. כדי לזהות SNPs במדגם, DNA גנומי מבודד מוגבר על ידי PCR ומפוצל כדי לשפר את יעילות כריכת הבדיקה. לאחר מכן ה- DNA מסומן, בדרך כלל עם סמן פלואורסצנטי, ואחריו הכלאה לשבב. לאחר שהדנ"א לדוגמה מותר להיקשר לבדיקות, כל הדנ"א הלא מאוגד או הלא קשור במיוחד נשטף. על ידי מדידת האות בכל נקודת בדיקה, ניתן לקבוע את נוכחותו של אלל המטרה במדגם.

שיטת הקלדת SNP נוספת היא PCR ספציפית לאל, שבה פריימרים מתוכננים כנגד רצפים המכילים SNP, כך שהם רק הכלאה אל אלל משלים לחלוטין. ניתן לזהות את מוצרי ה- PCR בשיטות כגון תגי פלורסנט. לחלופין, פריימרים PCR אגף את אתר SNP של עניין ניתן לעצב בשילוב עם בדיקה ספציפית SNP, כמו בבדיקת PCR TaqMan. כאן, הגשושית מכילה סמן פלואורסצנטי, כמו גם מולקולת קוונצ'ר המדכאת את הפלואורסצנטיות מהסמן הסמוך. במהלך PCR, רק רצף הבדיקה הקשורים במיוחד יהיה מושפל על ידי פעילות exonuclease 5′ של פולימראז, הפרדת תג פלואורסצנטי מן quencher וכתוצאה מכך אות פלואורסצנטי המציין את נוכחותו של וריאנט מסוים.

קטגוריה שלישית של שיטות, הנקראת ניתוח שברים, כוללת יצירת שברי DNA בגדלים או תוויות שונים, בהתבסס על נוכחות או היעדר SNP מסוים. ניתוח פולימורפיזם באורך קטע הגבלה מנצל את הספציפיות המחמירה של אנדונקולאזים מגבילים עבור רצפי היעד שלהם, כאשר אלל אחד הוא בקע והשני לא. בדיקת קשירה משתמשת בשתי בדיקות הממוקמות ישירות אחת ליד השנייה, שאחת מהן מסתיימת בבסיס המטרה של SNP. אם הבדיקה המכילה SNP נקשרת בצורה מושלמת, קשירה יכולה להתרחש. תפילת הארכת פריימר כוללת פריימרים שקושרים נוקלאוטיד אחד קצר מהמטרה SNP. פריימר זה הוא אז מורחב באופן משתנה בהתבסס על אלל בודדים הנוכחי. לאחר מכן ניתן להבדיל בין השברים הנוצרים בשיטות אלה באמצעות אלקטרופורזה ג'ל או נימי, או ספקטרומטריית מסה.

לבסוף, רצף יכול לזהות SNPs באופן ספציפי מאוד, כמו גם לזהות SNPs רומן עם רצפים לא ידועים. עם זאת, יש לבצע טיפול נוסף ושכפולים ניסיוניים נוספים כדי להבחין בין SNPs בפועל לבין שגיאות קריאה רציף. ככל שטכנולוגיות רצף הופכות לזולות ונגישות יותר, החוקרים משתמשים יותר ויותר ברצף עבור גנוטיפינג.

לאחר שראינו כיצד ניתן לגנוטיה, בואו נסתכל על כמה יישומים ספציפיים לטכניקות אלה.

ניתן להשתמש בגנוטיפינג כדי להבחין בין זנים של מין בעל מראה כמעט זהה. זה מושג על ידי בידוד הראשון של DNA גנומי, ואחריו PCR באמצעות פריימרים שנועדו לקשור רצפים עם SNPs ידועים או וריאנטים גנטיים אחרים. פריימרים אלה רק יגבירו את הדנ"א של המגוון המכיל את הפולימורפיזם הספציפי, ובכך ניתן להשתמש בהם כדי להבחין בין כפילים אלה.

החוקרים משתמשים גם בגנוטיפינג כדי לזהות חיידקים פתוגניים המטפחים מוטציות ספציפיות לעמידות לתרופות. פרוטוקול מערך SNP יעיל עבור הגדרות בעלות משאבים נמוכים נוצר על-ידי הוספת DNA גנומי ותערובת מאסטר-מאסטר של PCR ישירות לשבב. הגברה והיברידיזציה לדוגמה מתרחשות בשלב אחד. לאחר מכן, המערכים נשטפים, מוזלמים, והתוצאות מנותחות כדי לקבוע את נוכחותם או היעדרם של חיידקי שחפת, כמו גם מוטציות עמידות לתרופות.

לבסוף, SNPs יכול לשמש כדי להעריך את הפונקציה של וריאנטים גנטיים שנמצאו כדי להגדיל את הסיכון למחלות על ידי מחקרי אסוציאציה. כאן, מדענים ערכו ניסויים בקו תאים שהוא הטרוזיגוס עבור SNP "סמן" נייטרלי הממוקם בחלק מתמלל של גן מעניין, כמו גם SNP בדיקה לא רשום כי הוא הקשור למחלה. נבחר קו תא בקרה שלילי שהוא הטרוזיגוס עבור הסמן SNP, אך הומוזיגוס עבור הגרסה הקשורה ללא מחלות של SNP הבדיקה. הרחבת פריימר ספציפית לאל בוצעה על DNA גנומי, כמו גם cDNA הפוך מתעתק מ mRNA מבוטא. מוצרי הרחבת הפריימר הוכפלו לאחר מכן באמצעות ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF. על ידי השוואת השפע היחסי של שברים הקשורים אללים SNP הסמן שני, החוקרים יכולים לקבוע אם SNP הקשורים למחלה תוצאות ביטוי גנים מופחת.

הרגע צפית בסרטון של ג'וב על גנוטיפינג של אס.אן.פי. וידאו זה הציג את הרעיון והשימושים של SNPs, מספר שיטות בסיסיות המשמשות לזיהוי ואפיון SNPs, והדגיש שלושה יישומים של genotyping SNP. כמו תמיד, תודה שצפית!

Disclosures

לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter