Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

 
Click here for the English version

SNP 유전형 분석

Overview

단일 뉴클레오티드 다형성, 또는 SNPs는 인간에 있는 유전 변이의 일반적인 양식입니다. DNA에 있는 개별적인 기지에 있는 이 다름은 수시로 직접 유전자 발현에 영향을 미치지 않습니다, 그러나 많은 경우에 아직도 질병 관련 유전자를 찾거나 환자를 진단하기 위하여 유용할 수 있습니다. SN을 식별하기 위해 수많은 방법론이 설립되었습니다.

SNP Genotyping에 JoVE의 소개는 SN이 무엇이고 질병 관련 유전자를 확인하는 데 어떻게 사용될 수 있는지에 대해 논의함으로써 시작됩니다. 그런 다음 직접 혼성화, PCR 기반 방법, 단편 분석 및 시퀀싱을 포함한 몇 가지 일반적인 SNP genotyping 방법을 검사합니다. 마지막으로, 우리는 이 기술이 오늘 유전 연구에 어떻게 적용되는지에 대한 몇 가지 예를 제시합니다.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

유전 변이는 다른 인구 사이 둘 다 생깁니다, 그리고 개별 중 질병 감수성을 포함하여 특색에 있는 변이에 기여합니다. 가장 흔한 변이는 단일 뉴클레오티드 다형성, 또는 SNPs. SNP 지노티핑은 개별에 존재하는 이체의 특정 세트를 결정하는 것을 포함합니다.

이 비디오는 SNP 지노티핑의 일부 원리에 대해 설명하고, 몇 가지 일반적인 SNP 식별 방법을 소개하고, 마지막으로 이러한 기술의 일부 응용 프로그램에 대해 설명합니다.

먼저 SNP가 무엇이며 어떻게 genotyping에 사용할 수 있는지 에 대해 논의해 보겠습니다.

"다형성"은 동종 또는 유전 궤적의 다른 버전으로, 집단 내의 상당한 주파수에서 발견되며, 기본 대체뿐만 아니라 삽입 또는 삭제를 포함한다. 단일 뉴클레오티드 다형성은 단일 DNA 염기의 변이이다. SNPs는 전체 게놈 전반에 걸쳐 발생할 수 있으며 대부분은 단백질 구조 또는 유전자 발현을 변경하지 않습니다. 그러나, 그(것)들은 아직도 그들의 물리적인 근접 때문에 질병과 연관될 수 있습니다, 또는 "연결," 질병을 일으키는 유전 이체에. 한편, 낭포성 섬유증, 겸상적혈구 빈혈 및 β-탈라세미아와 같은 질병을 직접 유발하는 것으로 알려진 몇몇 저명한 SNP가 있다.

SNP 지노티핑에 대한 하나의 실용적인 응용 프로그램은 개인화 된 의학입니다, 여기서 질병과 관련된 SNP의 식별, 또는 약물이나 치료에 차등 반응, 의사가 더 나은 진단하고 환자를 치료하는 데 도움이 될 수 있습니다.

SNP는 또한 특성 또는 질병과 연관되는 것을 확인하기 위하여 전체 게놈에 걸쳐 수십만개의 SNPs를 검토하는 게놈 전체 협회 연구 결과를 위해 유용합니다. GWAS는 "haplotype"으로 알려진 SN의 그룹을 활용합니다. haplotype 내의 SNP는 "연결 실형"에 있으며, 이는 변형의 특정 조합이 우연히 예상보다 함께 발생할 가능성이 더 높다는 것을 의미하며, 종종 염색체에 대한 물리적 근접성의 결과입니다. 즉, haplotype은 소수의 개별 SNPs만 유전화하여 분화할 수 있으며, 유전 협회 연구를 비용 또는 노동 집약적으로 만듭니다.

SN이 무엇이고 어떻게 사용할 수 있는지 살펴본 후 유전자형 SNP로 개발된 수많은 방법론을 살펴보겠습니다. 여기에는 직접 혼성화, PCR 기반 방법, 단편 분석 및 시퀀싱이 포함됩니다.

SNP 어레이와 같은 직접 혼성화 기술은 짧은 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 개별 SNP를 직접 식별합니다. 수십만 개의 SN을 단일 바이오칩으로 테스트할 수 있습니다. 프로브는 일반적으로 유리 슬라이드인 칩 매트릭스에 화학적으로 고정됩니다. 샘플에서 SNPs를 검출하기 위해 격리된 게놈 DNA는 PCR에 의해 증폭되고 프로브 결합 효율을 개선하기 위해 단편화됩니다. DNA는 그 때 표지됩니다, 전형적으로 형광 마커로, 칩에 혼성화에 선행됩니다. 샘플 DNA가 프로브에 결합할 수 있게 되면 모든 언바운드 또는 비특이적으로 결합되지 않은 DNA가 씻겨 나옵니다. 각 프로브 지점에서 신호를 측정함으로써, 시료내의 표적 알렐의 존재를 결정할 수 있다.

또 다른 SNP 타이핑 방법은 원진 전용 PCR으로, 프라이머는 SNP 함유 시퀀스에 대해 설계되어 완벽하게 보완적인 적색에만 혼성화됩니다. PCR 제품은 형광 태그와 같은 방법으로 감지할 수 있습니다. 또는, 관심의 SNP 사이트를 측면 PCR 프라이머는 TaqMan PCR 분석에서와 같이 SNP 특정 프로브와 함께 설계 할 수 있습니다. 여기서, 프로브는 형광 마커뿐만 아니라 가까운 마커로부터 형광을 억제하는 담종 분자를 포함합니다. PCR 동안, 특이적으로 결합된 프로브 서열만이 폴리머라제의 5′ 엑소뉴클레아제 활성에 의해 저하되고, 광소 태그를 대기부로부터 분리하고 특정 이체의 존재를 나타내는 형광 신호의 결과로 생성된다.

단편 분석이라고 하는 방법의 세 번째 범주는 특정 SNP의 존재 또는 부재에 근거하여 다양한 크기 또는 레이블의 DNA 단편의 생성을 포함합니다. 제한 단편 길이 다형성 분석은 하나의 알렐이 갈라지고 다른 하나는 갈라지지 않는 대상 시퀀스에 대한 제한 엔토니의 엄격한 특이성을 활용합니다. 리기션 분석은 서로 바로 옆에 위치한 두 개의 프로브를 사용하며, 그 중 하나는 대상 SNP 베이스페어에서 종료됩니다. SNP 함유 프로브가 완벽하게 결합되면 결찰이 발생할 수 있습니다. 프라이머 확장 분석은 표적 SNP의 짧은 하나의 뉴클레오티드를 결합하는 프라이머를 포함한다. 이 프라이머는 존재하는 개별 적인 제일계에 기초하여 가변적으로 확장됩니다. 이러한 방법에 의해 생성된 단편은 겔 또는 모세관 전기포고증 또는 질량 분광법을 사용하여 분화될 수 있다.

마지막으로, 시퀀싱은 SN을 매우 구체적으로 감지할 수 뿐만 아니라 알 수 없는 시퀀스를 가진 새로운 SN을 식별할 수 있습니다. 그러나 실제 SNP를 시퀀싱 읽기 오류를 구분하기 위해 추가 주의 및 추가 실험 복제를 수행해야 합니다. 시퀀싱 기술이 점점 더 저렴해지고 접근성이 높아짐에 따라 연구자들은 genotyping을 위해 시퀀싱을 점점 더 활용하고 있습니다.

어떻게 SNP가 유전자형화될 수 있는지 를 보았을 때, 이러한 기술에 대한 몇 가지 구체적인 응용 사항을 살펴보겠습니다.

지노티핑은 거의 동일한 외관을 가진 종의 품종을 구별하는 데 사용할 수 있습니다. 이것은 먼저 유전체 DNA를 격리하여, 알려진 SNPs 또는 그밖 유전 이체와 순서를 결합하기 위하여 디자인된 프라이머를 사용하여 PCR에 선행됩니다. 이러한 프라이머는 특정 다형성을 포함하는 다양성의 DNA만 증폭시켜, 따라서 이러한 유사를 구별하는 데 사용될 수 있다.

연구원은 또한 특정 약물 저항 돌연변이를 품고 있는 병원성 박테리아를 확인하기 위하여 유전을 이용합니다. 저자원 설정을 위한 간소화된 SNP 어레이 프로토콜은 칩에 직접 게놈 DNA 및 PCR 마스터 믹스를 추가하여 확립됩니다. 샘플 증폭 및 혼성화는 한 단계에서 발생합니다. 어레이는 그 때 세척, 심상, 및 결과는 결핵 박테리아의 존재 또는 부재를 결정하기 위하여 분석됩니다, 뿐만 아니라 어떤 약 저항하는 돌연변이.

마지막으로, SNPs는 협회 연구 결과에 의하여 질병 리스크를 증가시키기 위하여 찾아낸 유전 이체의 기능을 평가하기 위하여 이용될 수 있습니다. 여기서 과학자들은 관심 유전자의 전사 부분에 위치한 중성 "마커" SNP뿐만 아니라 질병과 관련된 전사되지 않은 테스트 SNP를 위해 이종수구우스인 세포주를 실험하였다. 음의 대조군 세포주는 마커 SNP에 대한 이종고우스이지만, 시험 SNP의 비질환 관련 변이체에 대해 상동성이 선택된다. 알렐 특이적 프라이머 확장은 발현 mRNA로부터 전사된 cDNA뿐만 아니라 게놈 DNA에서 수행되었다. 프라이머 확장 제품은 MALDI-TOF 질량 분석법을 사용하여 수량화되었습니다. 두 마커 SNP 유전자와 관련된 단편의 상대적 풍부를 비교함으로써, 연구원은 질병 관련 SNP가 감소된 유전자 발현을 초래하는지 여부를 결정할 수 있습니다.

당신은 SNP 지노티핑에 조브의 비디오를 보았다. 이 비디오는 SN을 식별하고 특성화하는 데 사용되는 몇 가지 기본 방법인 SNP의 개념과 용도를 소개하고 SNP genotyping의 세 가지 응용 프로그램을 강조했습니다. 언제나처럼, 시청주셔서 감사합니다!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

이해 상충이 선언되지 않았습니다.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter