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Overview

Polimorfismos de nucleotídeos únicos, ou SNPs, são a forma mais comum de variação genética em humanos. Essas diferenças em bases individuais no DNA muitas vezes não afetam diretamente a expressão genética, mas em muitos casos ainda podem ser úteis para localizar genes associados à doença ou para diagnosticar pacientes. Inúmeras metodologias foram estabelecidas para identificar, ou "genótipo", SNPs.

A introdução do JoVE ao SNP Genotyping começa discutindo o que são SNPs e como eles podem ser usados para identificar genes associados a doenças. Vários métodos comuns de genotipagem snp são então examinados, incluindo hibridização direta, métodos baseados em PCR, análise de fragmentos e sequenciamento. Por fim, apresentamos vários exemplos de como essas técnicas são aplicadas à pesquisa genética hoje em dia.

Procedure

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A variação genética ocorre dentro e entre diferentes populações, e contribui para a variação de traços, incluindo suscetibilidade da doença, entre os indivíduos. As variações mais comuns são polimorfismos de nucleotídeos únicos, ou SNPs. A genotipagem SNP envolve determinar os conjuntos específicos de variantes, neste caso os SNPs, presentes em um indivíduo.

Este vídeo discutirá alguns dos princípios por trás do genotipagem SNP, dará uma introdução a vários métodos comuns de identificação do SNP e, finalmente, algumas aplicações dessas técnicas.

Primeiro, vamos discutir o que é um SNP e como ele pode ser usado em genotipagem.

"Polimorfismos" são alelos, ou diferentes versões de um lócus genético, encontrados em uma frequência considerável dentro de uma população, e incluem substituições de base, bem como inserções ou exclusões. Polimorfismos de nucleotídeos únicos são variações em uma única base de DNA. Os SNPs podem ocorrer em todo o genoma, e a maioria não altera a estrutura proteica ou a expressão genética. No entanto, eles ainda podem estar associados a doenças devido à sua proximidade física, ou "ligação", a uma variante genética causadora de doenças. Por outro lado, existem vários SNPs proeminentes que são conhecidos por causar diretamente doenças como fibrose cística, anemia falciforme e β-talassemia.

Uma aplicação prática para genotipagem SNP é a medicina personalizada, onde a identificação de SNPs que estão associados a doenças, ou com respostas diferenciais a uma droga ou terapia, pode ajudar os médicos a diagnosticar melhor e tratar os pacientes.

Os SNPs também são úteis para estudos de associação genoma, que examinam centenas de milhares de SNPs em todo o genoma para identificar aqueles que estão associados a traços ou doenças. O GWAS se aproveita de grupos de SNPs conhecidos como "haplotipos". Os SNPs dentro de um haplotipo estão em "desequilíbrio de ligação", o que significa que a combinação particular de variantes são mais propensas a ocorrer em conjunto do que o esperado por acaso, muitas vezes o resultado de sua proximidade física em um cromossomo. Isso significa que os heplotipos podem ser diferenciados por genotipar apenas um pequeno número de SNPs individuais, tornando os estudos de associação genética menos custos ou mão-de-obra intensivas.

Depois de olhar para o que são SNPs e como eles podem ser usados, vamos passar por várias das inúmeras metodologias que foram desenvolvidas para SNPs genótipo. Estes incluem hibridização direta, métodos baseados em PCR, análise de fragmentos e sequenciamento.

Técnicas de hibridização direta, como os arrays SNP, usam sondas de oligonucleotídeos curtas para identificar snps individuais diretamente. Centenas de milhares de SNPs podem ser testados em um único biochip. As sondas são quimicamente fixadas na matriz do chip, tipicamente um escorregador de vidro. Para detectar SNPs em uma amostra, o DNA genômico isolado é amplificado pelo PCR e fragmentado para melhorar a eficiência de ligação da sonda. O DNA é então rotulado, tipicamente com um marcador fluorescente, seguido de hibridização ao chip. Depois que o DNA da amostra é permitido ligar-se às sondas, todo o DNA não vinculado ou não especificamente ligado é lavado. Medindo o sinal em cada ponto da sonda, a presença do alelo alvo na amostra pode ser determinada.

Outro método de digitação SNP é o PCR específico para alelos, onde os primers são projetados contra sequências contendo SNP para que eles só hibridizem para o alelo perfeitamente complementar. Os produtos PCR podem ser detectados por métodos como tags fluorescentes. Alternativamente, os primers PCR que flanqueiam o site SNP de interesse podem ser projetados em conjunto com uma sonda específica snp, como no ensaio PCR TaqMan. Aqui, a sonda contém um marcador fluorescente, bem como uma molécula que saciar que suprime a fluorescência do marcador próximo. Durante o PCR, apenas a sequência da sonda especificamente ligada será degradada pela atividade exonuclease de 5′ da polimerase, separando a tag fluorescente do extintor e resultando em um sinal fluorescente que indica a presença da variante específica.

Uma terceira categoria de métodos, chamada análise de fragmentos, envolve a criação de fragmentos de DNA de vários tamanhos ou rótulos, com base na presença ou ausência de um SNP específico. A análise do polimorfismo do comprimento do fragmento de restrição aproveita a estrita especificidade dos endonucleases de restrição para suas sequências de destino, onde um alelo é cortado e o outro não. O ensaio de ligadura usa duas sondas situadas diretamente uma ao lado da outra, uma das quais termina no medial snp alvo. Se a sonda contendo SNP se ligar perfeitamente, a ligadura pode ocorrer. O ensaio de extensão do primer envolve primers que ligam um nucleotídeo a menos do ALVO SNP. Este primer é então variadamente estendido com base no alelo individual presente. Os fragmentos gerados por esses métodos podem então ser diferenciados usando eletroforese gel ou capilar, ou espectrometria de massa.

Finalmente, o sequenciamento pode detectar SNPs muito especificamente, bem como identificar novos SNPs com sequências desconhecidas. No entanto, cuidados extras e réplicas experimentais adicionais devem ser realizados para distinguir os SNPs reais dos erros de leitura de sequenciamento. À medida que as tecnologias de sequenciamento se tornam mais baratas e acessíveis, os pesquisadores estão cada vez mais utilizando o sequenciamento para genotipagem.

Tendo visto como os SNPs podem ser genótipos, vamos olhar para algumas aplicações específicas para essas técnicas.

Genotipagem pode ser usado para distinguir entre variedades de uma espécie com aparência quase idêntica. Isso é feito pela primeira isolação do DNA genômico, seguido pelo PCR usando primers projetados para ligar sequências com SNPs conhecidos ou outras variantes genéticas. Estes primers só amplificarão o DNA da variedade que contém o polimorfismo específico, e assim podem ser usados para distinguir entre esses sósias.

Os pesquisadores também usam genotipagem para identificar bactérias patogênicas que abrigam mutações específicas de resistência a drogas. Um protocolo de matriz SNP simplificado para configurações de baixo recurso é estabelecido adicionando DNA genômico e mixagem mestre PCR diretamente a um chip. A amplificação e a hibridização da amostra ocorrem em uma etapa. As matrizes são então lavadas, imagens e os resultados são analisados para determinar a presença ou ausência de bactérias da tuberculose, bem como quaisquer mutações resistentes a medicamentos.

Finalmente, os SNPs podem ser usados para avaliar a função das variantes genéticas encontradas para aumentar o risco de doenças por meio de estudos de associação. Aqui, os cientistas experimentaram uma linha celular heterozida para um SNP "marcador" neutro localizado na porção transcrita de um gene de interesse, bem como um SNP de teste não transcrito que está associado à doença. Uma linha celular de controle negativo é escolhida que é heterozigosa para o marcador SNP, mas homozigosa para a variante não associada à doença do teste SNP. A extensão de primer específica de alelo foi realizada em DNA genômico, bem como cDNA reversa transcrita de mRNA expresso. Os produtos de extensão de primer foram então quantitados usando espectrometria de massa MALDI-TOF. Comparando a abundância relativa dos fragmentos associados aos dois alelos SNP marcadores, os pesquisadores podem determinar se o SNP associado à doença resulta em expressão genética reduzida.

Você acabou de assistir o vídeo do JoVE sobre genotipagem SNP. Este vídeo introduziu o conceito e os usos de SNPs, vários métodos básicos utilizados para identificar e caracterizar SNPs, e destacou três aplicações de genotipagem SNP. Como sempre, obrigado por assistir!

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