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Uma visão geral da expressão genética
 
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Uma visão geral da expressão genética

Overview

A expressão genética é o processo complexo onde uma célula usa suas informações genéticas para fazer produtos funcionais. Esse processo é regulado em vários estágios, e qualquer má regulação pode levar a doenças como o câncer.

Este vídeo destaca importantes descobertas históricas relacionadas à expressão genética, incluindo a compreensão de como combinações distintas de bases de DNA codificam os aminoácidos que compõem proteínas. Questões-chave no campo da pesquisa de expressão genética são exploradas, seguidas de uma discussão de várias técnicas utilizadas para medir a expressão genética e investigar sua regulação. Finalmente, vemos como os cientistas estão usando essas técnicas para estudar a expressão genética.

Procedure

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A expressão genética é o processo onde as informações contidas no DNA de uma célula são usadas para fazer produtos funcionais. Este procedimento cuidadosamente orquestrado é regulado em várias etapas, e a má regulação pode muitas vezes resultar em doenças como o câncer.

Este vídeo fornece uma visão geral da história da pesquisa de expressão genética, questões-chave, métodos no campo e como essas técnicas estão sendo aplicadas.

Começaremos revendo algumas descobertas importantes sobre a expressão genética.

O primeiro modelo convincente de como o DNA poderia transportar informações genéticas foi estabelecido em 1953, quando Francis Crick e James Watson, com a ajuda dos dados de Rosalind Franklin, resolveram a estrutura do DNA — uma dupla hélice feita de duas cadeias lineares de bases nucleotídeos que estão dispostas em uma sequência definida, mas infinitamente variável.

Cinco anos depois, Crick propôs duas ideias importantes que formariam a espinha dorsal da nossa compreensão da expressão genética. Sua "hipótese de sequência" sugeriu que a sequência de nucleotídeos do DNA é usada, através de um intermediário RNA instável, como um código para sequências de aminoácidos de proteínas. Ao mesmo tempo, seu "dogma central" hipóteseva os diferentes fluxos de informações genéticas que podem ocorrer, e em particular, sustentava que as informações não podem ser transferidas da proteína de volta para ácidos nucleicos.

Em 1960, François Jacob e Jacques Monod — através de seu trabalho sobre genes metabolizadores de lactose em bactérias — propuseram um modelo para a regulação da expressão genética. Eles sugeriram que a expressão de "genes estruturais", que executam funções estruturais ou enzimáticas, é controlada pelos produtos de "genes regulatórios" que se ligam a locais regulatórios adjacentes. Sabemos agora que modos substancialmente semelhantes de regulação genética, mediados por proteínas chamadas fatores de transcrição, ocorrem em todos os organismos.

Um ano depois, em 1961, Jacob — juntamente com Sydney Brenner — descobriu o mensageiro ou "m"-RNA como o intermediário instável entre DNA e proteínas proposto por Crick. No mesmo ano, Brenner e Crick começaram a quebrar o "código genético", que dita como a informação no DNA codifica proteínas. Eles determinaram que cada trigêmeo de nucleotídeos adjacentes, ou um "códon", especifica um dos 20 aminoácidos que constituem proteínas.

Nos anos seguintes, pesquisadores liderados por Marshall Nirenberg, Har Gobind Khorana e Severo Ochoa usaram múltiplas abordagens para definir os aminoácidos codificados por todos os 64 códons possíveis. Com a quebra do código genético, os cientistas continuaram a investigar como a expressão genética é regulada.

Uma grande descoberta veio em 1974, quando Roger Kornberg e colegas mostraram que o DNA em células eucarióticas, como as de animais e plantas, está "envolto" em complexos de proteínas histonas, produzindo estruturas agora chamadas de "nucleosmos". Sabemos agora que as mudanças na estrutura da cromatina desempenham papéis importantes na regulação genética.

Outra reviravolta veio em 1977, quando Phil Sharp e Rich Roberts descobriram que as sequências de mRNA não eram totalmente complementares aos seus modelos de DNA correspondentes. Certas "regiões desaparecidas", agora chamadas introns, são removidas entre os exons de codificação de proteínas na transcrição madura do RNA em um processo conhecido como "emenda". Cinco anos depois, o grupo de pesquisa de Ronald Evans demonstrou que o splicing "alternativo" da mesma transcrição poderia produzir variantes, ou "isoformas", da mesma proteína com funções diferentes.

Desde a década de 1990, nosso entendimento da complexidade das redes reguladoras genéticas expandiu-se dramaticamente com a descoberta do silenciamento genético mediado pelo RNA. Sabemos agora que várias famílias diferentes de pequenas RNAs, com membros de 20 a 30 nucleotídeos de tamanho, regulam a expressão genética de várias maneiras.

Depois de rever a história da pesquisa de expressão genética, vamos olhar para algumas questões importantes no campo.

Um tópico que está sendo investigado é como os fatores de transcrição regulam os genes. Os cientistas não só estão interessados em identificar as sequências genômicas ligadas por fatores de transcrição, mas também estão analisando como as proteínas regulatórias interagem entre si para integrar sinais e regular a expressão genética.

Outros pesquisadores estudam emendas alternativas e como esse processo é regulado em diferentes contextos biológicos. Além disso, alguns deles estão tentando determinar se isoformas proteicas sempre têm funções diferentes e distintas.

Finalmente, muitos pesquisadores estão investigando o mecanismo de ação de pequenas RNAs, e estão tentando identificar seus alvos regulatórios. Há também um crescente interesse em saber se pequenas RNAs podem ser usadas como "biomarcadores" para diagnosticar doenças.

Agora, vamos olhar para as ferramentas que os pesquisadores usam para avaliar a expressão genética.

Um método popular é a transcrição reversa, ou "RT"-PCR, que converte o RNA em DNA complementar ou "c" antes de subesá-lo à amplificação. Ao incluir moléculas fluorescentes que são incorporadas ao DNA durante o PCR, é possível usar essa técnica para medir quantitativamente a expressão genética e observar os resultados em "tempo real".

Para avaliar simultaneamente a expressão de milhares de genes, microarrays podem ser usados. Aqui, as sequências de DNA são "impressas" em slides, que são então hibridizadas para sondas fluorescentes geradas a partir de RNA amostral. O padrão resultante de fluorescência pode ser usado para identificar genes expressos.

Outra técnica para traçar a expressão genética é sequenciar o transcriptome, ou todos os RNAs expressos em uma célula. Aqui, o cDNA gerado a partir de amostras de RNA é submetido a sequenciamento de alto rendimento. Ao contrário das microarrays, o sequenciamento de transcriptome não requer informações genômicas pré-existentes, e pode ser usado para identificar transcrições desconhecidas ou novos isoformas genéticas.

Os pesquisadores também podem avaliar visualmente onde um gene é expresso usando a hibridização in situ. Nesta técnica, o RNA é primeiro hibridizado com sondas complementares, que podem então ser reconhecidos por anticorpos conjugados por enzimas que produzem uma cor visual ou sinal de fluorescência.

O ensaio do repórter é outra técnica que pode fornecer informações sobre a regulação genética. O produto genético repórter gera um sinal como cor ou fluorescência. O repórter talvez fundiu-se diretamente a um gene de interesse, ou ser colocado sob o controle de uma sequência regulatória, como o promotor que impulsiona a transcrição de um gene, ou um elemento mais distante do aprimoramento. O sinal do repórter pode então agir como leitura para a atividade do elemento regulador, ou o padrão de expressão do gene de interesse.

Finalmente, a imunoprecipitação de cromatina ou "ChIP" pode ser usada para identificar os locais genômicos aos quais os fatores de transcrição se ligam ao regular a expressão genética. Aqui, complexos de proteínas e o DNA que se ligam são isolados por anticorpos, e o DNA alvo é identificado por PCR ou sequenciamento.

Depois de examinar os métodos para estudar a expressão genética, vamos olhar para algumas de suas aplicações.

Células dentro de uma população podem apresentar diferenças sutis na expressão genética que podem ter consequências biológicas. Neste estudo, os pesquisadores colocaram células-tronco embrionárias humanas individuais da mesma cultura em poços separados em uma placa. Usando RT-PCR quantitativo, os cientistas determinaram que a expressão de Nanog,um "marcador" de células-tronco, diferia dentro de uma amostra.

Alguns pesquisadores investigam se diferentes isoformas das proteínas regulatórias funcionam de forma diferente. Aqui, o ChIP foi aplicado às células imunes humanas para identificar os alvos de ligação das isoformas "longas" e "curtas" de uma proteína. Os resultados de sequenciamento mostraram que alguns alvos genéticos só foram reconhecidos pela isoforme curta, apontando para potenciais diferenças funcionais.

Finalmente, os ensaios de repórteres podem ser usados para avaliar a regulação genética mediada por pequenas RNAs, como microRNAs. Como microRNAs podem inibir a expressão genética ligando-se às regiões não traduzidas de 3 centavos de mRNAs, os cientistas anexaram essa região de diferentes genes a um repórter de luciferase, e introduziram cada uma delas em células, juntamente com um microRNA. Os alvos genéticos do microRNA foram então identificados procurando células com sinal de luminescência reduzido.

Você acabou de assistir a introdução de JoVE à expressão genética. Revisamos grandes descobertas em pesquisas de expressão genética, perguntas e métodos proeminentes no campo e algumas aplicações atuais. Como sempre, obrigado por assistir!

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