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Una panoramica dell'ingegneria genetica
 
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Una panoramica dell'ingegneria genetica

Overview

L'ingegneria genetica – il processo di alterazione intenzionale del DNA di un organismo – è stata utilizzata per creare potenti strumenti di ricerca e organismi modello, e ha anche visto molte applicazioni agricole. Tuttavia, al fine di progettare tratti per affrontare problemi agricoli complessi come la tolleranza allo stress, o per realizzare la promessa della terapia genica per il trattamento delle malattie umane, sono ancora necessari ulteriori progressi nel campo. Considerazioni importanti includono la consegna sicura ed efficiente di costrutti genetici in cellule o organismi e l'istituzione della modifica desiderata nel genoma di un organismo con i minimi effetti "fuori bersaglio".

La Panoramica dell'ingegneria genetica di JoVE presenterà una storia del campo, evidenziando le scoperte che hanno confermato il DNA come materiale genetico e hanno portato allo sviluppo di strumenti per modificare il DNA. Verranno quindi introdotte domande chiave a cui è necessario rispondere per migliorare il processo di ingegneria genetica, insieme a vari strumenti utilizzati dagli ingegneri genetici. Infine, esamineremo diverse applicazioni che dimostrano i tipi di domande e strategie sperimentali nel campo oggi.

Procedure

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L'ingegneria genetica è l'alterazione intenzionale del DNA di un organismo. I progressi in questo campo hanno permesso agli scienziati di generare cellule e organismi geneticamente modificati per la ricerca biomedica e scopi agricoli. Tuttavia, l'applicazione di tecnologie genetiche per l'uso come terapia nell'uomo, nota come terapia genica, è ancora un lavoro in corso.

In questo video, discuteremo alcune importanti scoperte nella storia dell'ingegneria genetica, le principali domande studiate oggi, importanti strumenti per alterare il genoma di un organismo e diverse applicazioni di queste tecnologie.

Iniziamo rivedendo la storia dell'ingegneria genetica.

La capacità degli scienziati di manipolare direttamente i geni dipendeva dalla risoluzione dell'identità del materiale genetico. Nel 1928, Frederick Griffith osservò che l'iniezione di un mix di batteri virulenti uccisi dal calore e un ceppo vivo, ma non virulento, nei topi provocava malattie, portandolo a ipotizzare un "principio di trasformazione" che si trasferì dai morti ai batteri vivi.

Nel 1944, Oswald Avery, Colin Macleod e Maclyn McCarty identificarono il DNA dei batteri come responsabile di questa trasformazione. Il risultato fu ulteriormente convalidato nel 1952, quando Alfred Hershey e Martha Chase usarono batteriofago radioattivamente etichettati per dimostrare che è il DNA del virus, e non la proteina, che è stato trasmesso durante la sua infezione delle cellule batteriche.

Sempre nel 1952, Joshua Lederberg ipotizzò l'esistenza di plasmidi, piccoli pezzi circolari di DNA che possono essere trasmessi tra i batteri. Più o meno nello stesso periodo, ha anche descritto la trasduzione, in cui i virus agiscono come vettori per trasmettere il DNA tra le cellule.

A partire dal 1970 circa, ricercatori come Hamilton Smith hanno iniziato a scoprire alcuni degli "strumenti" pratici dell'ingegneria genetica, come le endonucleasi di restrizione, che "tagliano" il DNA in sequenze specifiche. Utilizzando questi strumenti, nel 1972, Paul Berg generai la prima molecola di DNA "ricombinante" unendo il DNA di due diversi virus e, in parallelo, Stanley Cohen e Herbert Boyer generavano il primo organismo ricombinante posizionando un gene di resistenza agli antibiotici su un plasmide e trasformando quel costrutto nel batterio E. coli.

Nel 1973, Rudolf Jaenisch creò il primo organismo multicellulare transgenico, un topo contenente DNA virale SV40, anche se non fu fino al 1981 quando diversi altri laboratori crearono i primi topi transgenici in grado di trasmettere i geni inseriti alla loro prole. A metà degli anni 1980, Mario Capecchi e Oliver Smithies stabilirono per la prima volta che la ricombinazione omologa poteva essere utilizzata per colpire specificamente i geni, e nel 1989 usarono questo metodo per generare il primo topo knockout, in cui un gene è reso non funzionale.

Successivamente, esaminiamo alcune domande chiave nell'ingegneria genetica.

Un'area di ricerca integrale è determinare il metodo migliore per modificare il genoma di un organismo. È necessario considerare una serie di fattori, tra cui l'efficienza del processo di modifica, nonché se la modifica debba essere mirata a geni specifici per ridurre al minimo i rischi di alterazioni non intenzionali del DNA cellulare.

Al fine di modificare il genoma di una cellula ospite, la sequenza di DNA assemblata artificialmente per apportare questa modifica, nota come "costrutto genetico", deve essere consegnata con successo in quella cellula. La ricerca in questo settore mira a massimizzare l'efficienza limitando la citotossicità. A livello di organismo, i ricercatori studiano come modificare vettori come particelle retrovirali o nanoparticelle per migliorare la consegna dei costrutti alle popolazioni cellulari bersaglio.

Infine, c'è molto interesse sul fatto che l'ingegneria genetica possa essere applicata con successo a usi agricoli o terapeutici. Queste tecnologie sono state utilizzate per generare potenti strumenti di ricerca come topi con geni cancellati o "knocked-out", o per inserire semplici tratti singoli come la resistenza agli erbicidi nelle colture. Tuttavia, problemi complessi, come la generazione di colture che prosperano in condizioni avverse, richiederanno probabilmente la modifica di più percorsi contemporaneamente. Inoltre, lo sviluppo di terapie geniche per il trattamento di malattie genetiche, che richiedono una consegna sicura ed efficace di costrutti genetici alle cellule umane, rimane un compito impegnativo.

Diamo ora un'occhiata agli strumenti e alle tecnologie di ingegneria genetica utilizzati dai ricercatori.

Il metodo classico per generare costrutti genetici è la clonazione basata su enzimi di restrizione, in cui i pezzi di DNA vengono digeriti e quindi ricombinati in ordine specifico utilizzando le ligas del DNA per creare un nuovo plasmide. Le tecniche più recenti includono la ricombinazione, che utilizza la ricombinazione omologa per isolare e scambiare frammenti di DNA senza la necessità di siti di digestione enzimatica di restrizione.

Il DNA può essere consegnato nelle cellule con una serie di metodi. La trasformazione o trasfezione è il processo di ottenere DNA nudo in cellule batteriche o eucariotiche, rispettivamente. I cationi bivalenti, come il calcio, possono rendere le membrane cellulari più porose, il che aumenterà l'assorbimento di molecole di DNA esogene. L'elettroporazione utilizza un campo elettrico per svolgere lo stesso compito, mentre le nanoparticelle lipidiche che circondano il DNA possono fondersi con la membrana cellulare e rilasciare il suo carico utile. La trasduzione si riferisce al trasferimento di DNA da parte di un vettore virale, come un lentivirus.

Fornire costrutti genetici in organismi multicellulari richiede ulteriori considerazioni. Quando sono presenti più tipi di cellule, vettori mirati come virus o nanoparticelle aumentano la specificità della consegna cellulare. Nelle piante, i ricercatori hanno cooptato l'agrobatterio, un patogeno vegetale in grado di trasferire il DNA alle cellule vegetali, come strumento di consegna dei geni. "Biolistics" si riferisce all'uso di una "pistola genetica" per fornire perle d'oro rivestite di DNA nelle cellule.

Infine, i costrutti del DNA consegnati devono apportare modifiche permanenti al genoma dell'ospite al fine di ottenere effetti a lungo termine. Ciò può avvenire mediante l'integrazione casuale del costrutto del DNA consegnato nel DNA ospite, che può essere migliorato etichettando il costrutto con siti di riconoscimento per gli enzimi "taglia e incolla" del DNA chiamati transposasi. D'altra parte, tecniche come il targeting genico tramite ricombinazione omologa consentono l'integrazione in siti genomici specifici. I recenti progressi nelle tecniche note come genome editing, che utilizza nucleasi progettate su misura per generare rotture a doppio filamento in loci specifici, migliorano notevolmente l'efficienza del targeting genico.

Ora, diamo un'occhiata a come le tecnologie di ingegneria genetica vengono applicate oggi.

Le funzioni cellulari negli eucarioti sono compartimentate in organelli e indirizzare l'espressione proteica transgenica ai singoli compartimenti può consentire effetti biologici più specifici. In questo esperimento, i ricercatori hanno generato un costrutto reporter con tag GFP utilizzando la tecnica di assemblaggio Gibson, in cui regioni omologhe di sovrapposizione tra più prodotti PCR consentono la generazione di un costrutto completo senza l'uso di enzimi di restrizione. La trasfezione biolistica è stata utilizzata per fornire questi costrutti nelle cellule vegetali e i ricercatori sono stati in grado di dimostrare l'espressione GFP mirata al cloroplasto.

Le cellule tumorali spesso sovra-esprimono i recettori di superficie, che i ricercatori possono indirizzare utilizzando la terapia genica. Qui, gli scienziati hanno stabilito un modello di cancro della vescica umana nel topo. Questo è seguito dalla consegna topica di un vettore adenovirale alle cellule tumorali della vescica. L'osservazione dell'espressione della luciferasi nelle cellule tumorali ha indicato il successo della consegna del gene reporter.

Infine, si stanno compiendo progressi nell'ingegnerizzazione di percorsi biologici completi in un organismo bersaglio. Qui, ogni gene della via biosintetica per l'antibiotico eritromicina è stato isolato dai suoi batteri ospiti, Saccharopolyspora erythraea, tramite PCR e combinato in costrutti simili a operoni in cui una serie di geni sono posti sotto controllo dagli stessi elementi regolatori per consentire un'espressione ottimale. Questi costrutti sono stati poi trasformati in E. coli per ricostituire la via di sintesi, e il prodotto prodotto in modo eterologo poteva quindi essere purificato e testato per la funzionalità.

Hai appena visto la panoramica di JoVE sull'ingegneria genetica. In questo video, abbiamo discusso la storia dell'ingegneria genetica, esaminato le principali domande, gli strumenti sul campo e presentato diversi esempi di applicazioni di ingegneria genetica. Come sempre, grazie per aver guardato!

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