ניתוח המשובטים של תא גזע Hematopoietic מבשרי באמצעות אינדקס תא בודד מיון משולב עם תאי אנדותל נישה תרבות משותפת

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לזהות את התכונות הפנוטיפיות ופוטנציאל ההשתלה של תאי גזע המטופויאטיים משובטים או מבשרי HSC במהלך ההתפתחות העוברית של העכברים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ההמטופואיזיס ההתפתחותי לגבי תרומות השושלת הייחודיות של מבשרי HSC משובטים במהלך ההתפתחות העוברית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שקודמנים המוגניים מנותחים ברמת התא הבודד.

זה מאפשר לזהות את התכונות הפנוטיפיות הייחודיות המבדילות בין מבשרי HSC נדירים. התחל בהוספת Aorta-Gonad-Mesonephros, AGM, רקמות שנותחו מעוברים בין 9.5 ל-11.5 ימים לאחר קיום יחסי מין לצינור חרוטי של 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר PBS בתוספת 10% FBS על קרח. כאשר הרקמות התייצבו בתחתית הצינור, שאפו את הסופרנטנט והוסיפו מיד מיליליטר אחד של 0.25% קולגנאז לדגימות.

לאחר 25 דקות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס, עצרו את התגובה עם מיליליטר אחד של PBS בתוספת FBS והשתמשו בקצה פיפטה של מיליליטר אחד כדי לשלש את הרקמות 20 עד 30 פעמים עד לקבלת תרחיף תא בודד. לאחר מכן יש לדלל את התאים בשמונה מיליליטר נוספים של PBS בתוספת FBS ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה. השעו מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של חיץ חוסם למשך חמש דקות על קרח.

לאחר מכן הוסף 500 מיקרוליטר מקוקטייל הנוגדנים המעניין. לאחר דגירה של 15 עד 20 דקות על קרח, שטפו את התאים בשמונה מיליליטר PBS בתוספת FBS והשעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של PBS טרי בתוספת FBS. סנן את התאים דרך מסננת תאים של 35 מיקרומטר לתוך צינור של חמישה מיליליטר, שטוף את המסננת עם שלושה מיליליטר נוספים של PBS בתוספת FBS כדי לאסוף את כל התאים ולצנטריפוגה שוב את התאים.

לאחר מכן השעו מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר PBS בתוספת FBS והניחו את התאים על קרח. כדי להגדיר את השערים למיון במצב מיון תא בודד ואינדקס, טען כמות קטנה של תאים על ציטומטר הזרימה והגדר את הרכישה לקצב הזרימה הנמוך ביותר. פתח תרשים אזור פיזור קדימה לעומת אזור פיזור צדדי והגדר שער שיכלול תאים בגדלים משתנים.

פתח אזור פיזור קדימה לעומת תרשים רוחב פיזור קדימה ואזור פיזור צדדי לעומת תרשים רוחב פיזור צדדי והגדר שער בכל חלקה כדי לא לכלול את הכפילים. הגדר אזור פיזור קדימה לעומת תרשים DAPI כדי לשער את התאים החיים. לאחר מכן צור תרשים קולטן Cadherin אנדותל אנטי-וסקולרי לעומת חלבון C אנטי-אנדותליאלי ושער את תאים המבטאים קולטן חלבון C חיובי ואנדותל אנדותל גבוה.

כדי למיין את תאי אבי העורקים-גונד-מזונפרוס, הנח צלחת של 96 בארות שתרבית מראש עם תאי אנדותל AGM במדיום נטול סרום AGM בתוספת ציטוקינים לתוך בלוק הצלחת של ציטומטר הזרימה וטען את דגימת הניסוי. התחל את רכישת הדגימה ואשר שמצב התא היחיד של מיון האינדקס נבחר כדי למיין תא בודד לכל באר של צלחת 96 הבארות. כאשר תא אחד ממוין לכל באר של הצלחת, הנח את הצלחת באינקובטור תרבית רקמה המוגדר ל-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך עד שבעה ימים.

בסוף תקופת התרבות המשותפת, ניתן לדמיין מושבות המטופויאטיות בגדלים ומורפולוגיה שונים באמצעות מיקרוסקופ הפוך בהגדלה של פי 100. כדי לנתח את השיבוטים על ידי ציטומטריית זרימה, השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי לנתק את התאים ההמטופויאטיים משכבות האנדותל מבלי לנתק את תאי האנדותל. לאחר מכן העבירו 100 מיקרוליטר תאים לבארות בודדות של צלחת תחתונה חדשה של 96 בארות והחזירו את הצלחת המקורית של 96 בארות המכילה את 100 המיקרוליטרים הנותרים של תאים לחממת תרבית הרקמות.

גלולה את התאים בצלחת ה-V התחתונה על ידי צנטריפוגה והסר את הסופרנטנט על ידי היפוך והזזה של הצלחת בתנועה מהירה אחת. השעו מחדש את הכדורים בכל באר עם 50 מיקרוליטר של חיץ חוסם בארבע מעלות צלזיוס. לאחר חמש דקות, הוסיפו את קוקטייל הנוגדנים המעניין לכל באר לדגירה של 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

בתום הדגירה יש לשטוף כל באר עם 200 מיקרוליטר PBS בתוספת FBS, תוך תנועת הצלחת בסוף הצנטריפוגה כדי להשליך את הסופרנטנט. השעו מחדש את הכדורים ב-50 מיקרוליטר של PBS בתוספת FBS ונתחו את התאים על פי פרוטוקולי ניתוח זרימה סטנדרטיים כדי לסנן מושבות המכילות פוטנציאל לתאי גזע המטופויאטיים. בחירת הבארות המכילות תאים עם פנוטיפ תאי גזע המטופויאטיים על ידי ניתוח זרימה, השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להשעות מחדש את 100 המיקרוליטרים הנותרים של התאים מהתרבות המשותפת המקורית ולהוסיף חמש פעמים 10 לתאי מח עצם ההצלה הרביעיים ב-100 מיקרוליטר PBS בתוספת 2% FBS לכל באר.

לאחר העברה מאמצת של כל שיבוט לבעלי חיים נמענים קונגניים בודדים המוקרנים באופן קטלני, אסוף דגימות דם היקפיות מבעלי החיים המושתלים במרווחי זמן קבועים לאחר ההשתלה. כדי לזהות את השיבוטים עם חריטה לטווח ארוך, נתח את הדגימות על ידי זרימה ציטומטרית על פי פרוטוקולי ניתוח זרימה סטנדרטיים. לאחר מכן ניתן לתאם את התכונות הפנוטיפיות של כל שיבוט עם תכונות ההשתלה שלו.

תאי גזע קדם-המטופויאטיים יכולים להיות מועשרים על ידי חיובי Cadherin אנדותל כלי דם ורמה גבוהה של ביטוי קולטן חלבון C אנדותל. צביעה עם נוגדנים מצומדים פלואורוכרומים אחרים מאפשרת ניתוח רטרוספקטיבי של פרמטרים פנוטיפיים נוספים שניתן לרשום עבור כל תא במהלך מיון האינדקס. לאחר מיון אינדקס לתרביות תאי אנדותל אבי העורקים-גונד-מזונפרוס, השיבוטים הבודדים משתלבים בשכבת תאי האנדותל של אבי העורקים-גונד-מזונפרוס לפני שהשיבוטים מתחילים להתעגל וליצור אשכולות המטופויאטיים.

לאחר חמישה עד שבעה ימים של תרבית משותפת, ניתן לזהות מושבות בגדלים ומורפולוגיה שונים. כאן, מוצגות ארבע מושבות שונות שהתקבלו בעקבות תרבית משותפת עם שלוש מושבות המדגימות פרופורציות שונות של תאי גזע המטופויאטיים פנוטיפיים יחד עם סוגי תאים מובחנים יותר והמושבה הרביעית חסרה תאים עם ביטוי סמני תאי גזע המטופויאטיים. העברה מאמצת של צאצאי תאי השיבוט מאפשרת הערכה של יכולת ההשתלה הרב-שושלת ארוכת הטווח של כל שיבוט בעקבות תרומת התורם לתאי תאי B ו-T המיאלואידים של הדם ההיקפי של הנמען לאורך זמן.

למרות שרוב המושבות המכילות תאים עם פנוטיפ תאי גזע המטופויאטי השיגו השתלה לטווח ארוך, השתלה נחוצה כדי לאשר השתלה רב-שושלת פונקציונלית מכיוון שחלק מהשיבוטים מאבדים את ההשתלה עם הזמן. לאחר מכן ניתן לתאם את פוטנציאל תאי הגזע ההמטופויאטיים הפונקציונליים של כל שיבוט לפרמטרי מיון האינדקס המקוריים של אותו שיבוט כדי לזהות את המאפיינים הפנוטיפיים המדויקים שלו. לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו תרבית משנית של צאצאים המטופויאטיים על סטרומה התומכת בהתפתחות תאי B ו-T במבחנה כדי לענות על שאלות נוספות לגבי פוטנציאל הלימפוציטים של קודמנים המוגניים בודדים.