בידוד של Murine העוברי Hemogenic לתאי אנדותל

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד תאי אנדותל המוגניים ראשוניים מרקמות עובריות של עכברים באמצעות מיון תאים המופעל על ידי תפרחת. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת בידוד אמין וספציפי של תאי אנדותל המוגניים ברי קיימא מרקמות המטופויאטיות עובריות. לאחר מכן ניתן להשתמש בתאים אלה לניתוח ותרבית לאחר מכן.

תאי האנדותל ההמוגניים כמו גם תאי הגזע והאב ההמטופויאטיים שניתן לבודד בשיטה זו ישמשו לאחר מכן כדי לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי ויסות התפתחותם ותפקודם. בדרך כלל אנשים חדשים בשיטה זו עשויים להתקשות בזיהוי אוכלוסיית הצד של תאים הכוללת את תאי האנדותל ההמוגניים, ותאי גזע ואב המטופויאטיים. הליכי החיתוך והסריקה של הרקמה העוברית יודגמו על ידי קאט מרסלו, סטודנטית לשעבר לתואר שני מהמעבדה שלי.

כמו גם אמילי גריטס, עמיתת מחקר קלינית נוכחית. וג'ן פאנג, פוסט-דוקטורנטית בהווה. התחל בניגוב כל משטחי העבודה עם 70% אתנול והנחת כרית סופגת על משטח ספסל המעבדה.

לאחר מכן הניחו גבעול מורדם על הכרית התחתונה וריססו בנדיבות את הבטן התחתונה באתנול 70%. בצע חתך אופקי ארוך בניצב לקו האמצע של דופן הבטן התחתונה. ואחריו שני חתכים אופקיים נוספים של סנטימטר אחד הנמשכים למעלה ולמטה מנקודת האמצע של החתך האופקי.

לאחר מכן נתחו את דופן הבטן כדי לחשוף במלואם את קרני הרחם הימנית והשמאלית המכילות את העוברים המרובים בהריון. בעזרת מלקחיים תפסו אחת משתי קרני הרחם והשתמשו במספריים ומלקחיים כדי להפריד את הרחם מהשריר שמסביב. ולהעביר את שתי הקרניים לצלחת תרבית רקמת פוליסטירן סטרילית בגודל 60 מילימטר על קרח.

הנח את הצלחת מתחת למיקרוסקופ ניתוח אור רגיל, והשתמש במלקחיים כדי להפריד כל יחידת שליה עוברית. עבור כל יחידה יש לנתח את השכבה השרירית של כל שק רחם, ולחשוף את שק ההריון הבסיסי ואת הדצידואה. כדי לבודד את שק החלמון, הסר בעדינות כמה שיותר מהשק מהעובר הסגור.

הוצאת שאר רקמת שק העול מהעובר במקור העוברי של כלי הוויטלין לפי הצורך. כדי לבודד את אבי העורקים-גונד-מזונפרוס או AGM, יש לחצות את העובר מתחת ללב ולגפיים הקדמיות ולהשליך את אזור בית החזה והראש. לאחר מכן חצו את העובר ממש מתחת לגפיים האחוריות, והסירו והשליכו את רקמת הזנב.

לאחר מכן הסר את הגפיים האחוריות ואת רקמת הגחון העודפת מהקטע הנותר המכיל AGM. כאשר כל שק חלמון או AGM נקצר, אסוף את הרקמות העובריות ב-HPSS+ בצינורות של 1.5 מיליליטר על קרח. כדי ליצור תרחיף תא בודד, צנטריפוגה של הרקמה העוברית, והשעיה מחדש של כדור הרקמה במיליליטר אחד של קולגנאז מסוג 2 מדולל ב-HPSS+דגירה של הצינור למשך 30 דקות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.

ערבוב על ידי היפוך כל חמש דקות. בתום הדגירה, העבירו את הדגימה 10 פעמים דרך פיפטה P1000 כדי לנתק בעדינות את הרקמה באופן מכני. לאחר מכן סובב שוב את הדגימה, והשהה מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של HPSS+Now קר כקרח, סנן את הדגימה באמצעות מסננת תאים של 70 מיקרון, וספור את התאים.

לאחר הספירה אוספים את התאים שוב על ידי צנטריפוגה. ולהשעות מחדש את הגלולה ב-37 מעלות צלזיוס DMN+בריכוז של 10 עד 6 תאים למיליליטר. כדי לתייג את התאים למיון fac, יש לצרף לפחות 100 מיקרוליטר של תאים לצינורות של 1.5 מיליליטר ולהוסיף וראפמיל מדולל ב-95% אתנול ל-hoechst בלבד בתוספת צינור בקרה של verapamil לריכוז סופי של 50 מיקרו-מולרי.

הניחו את כל הצינורות בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן הוסיפו את ה-hoechst ל-hoechst בלבד ואת hoechst plus verapamil רק לצינורות בקרה, ואת צינור הדגימה לריכוז סופי של חמישה מיקרוגרם למיליליטר והחזירו את הצינורות ל-37 מעלות צלזיוס למשך שעה מוגנת מאור, תוך ערבוב עדין של הצינורות על ידי היפוך כל 15 דקות. בתום צנטריפוגת הדגירה כל הדגימות ודלל את הכדורים לריכוז חד פעמי של 10 עד חמישית תאים למיליליטר ב-HPSS קר+כעת הוסף נוגדנים מצומדים פלואורסצנטיים לצינורות הבקרה המתאימים של נוגדנים בלבד, ולצינור הדגימה לריכוז סופי של שני מיקרוגרם למיליליטר לדגירה של 30 דקות על קרח מוגן מאור.

בתום הדגירה, סובבו את הדגימות ותלו מחדש את הכדורים ב-500 מיקרוליטר של HPSS קר כקרח. מסננים את הדגימות דרך מכסי מסנן הרשת של צינורות פוליסטירן תחתונים עגולים של חמישה מיליליטר, ומניחים את הצינורות על קרח מוגן מפני אור. ואז נתח מיד את התאים על ידי ציטומטריית זרימה.

בעקבות הבחנה סטנדרטית של תאים חיים וכפולים על ידי פיזור צד קדימה וצדדית, אירועי אוכלוסייה צדדית מוצגים בתרשים הנקודה האדומה הליניארית לעומת הוכסט הכחולה כאשר כתף שמאלה מוסטת מאירועי אוכלוסייה שאינם צדדיים. אוכלוסיית צד זו מצטמצמת משמעותית עם טיפול בוורפאמיל. תאי האוכלוסייה הלא-צדדית מזוהים כמקבץ הצפוף של התאים הסמוכים לאוכלוסיית הצד.

חלק התאים שאינו צד מכיל תאי אנדותל לא המוגניים אשר נבדלים עוד יותר כאירועי CD31+CD45. כדי לזהות את תאי הגזע והאב ההמטופויאטיים ותאי האנדותל ההמוגניים, שערי בת נמשכים מחלק האוכלוסייה הצדדית החושף את תאי CD45+ ו-CD45. תאי האנדותל ההמוגניים מזוהים לאחר מכן מתאי CD45 בחלקת cKit דיפרנציאלית לעומת בת Flk1 כאירועים חיוביים כפולים.

תאי הגזע והאב ההמטופויאטיים מזוהים מהשבר CD45+בתרשים בת נפרד כתאי Flk1-cKit+. בעקבות הליך זה ניתן להגדיר תרביות מבוססות מתיל תאית כדי לספק הערכה תפקודית של היכולת ההמטופויאטית של התאים המבודדים או לעבד את התאים באופן מיידי לניתוחי ביטוי גנים וחלבונים. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך כארבע עד חמש שעות אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על הדגימות מוגנות מפני אור ועל קרח, אלא אם כן צוין אחרת כדי למקסם את כדאיות התא. טכניקה זו אפשרה לחוקרים בתחום הביולוגיה של כלי הדם של המוטו לחקור את המפרט ההמוגני של תאי אנדותל ואת ייצורם של תאי גזע ואב המטופויאטיים במהלך ההתפתחות העוברית. לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד תאי אנדותל המוגנים מרקמות עובריות של עכברים באמצעות ציטומטריית זרימה.

תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.