Muismodellen van Helicobacter infectie en maag pathologieën

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van gastro-enterologie over de impact van leden van de microbiota, met name die van het geslacht Helicobacter, op ontsteking en kanker. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de studie van Helicobacter-infectie en de impact ervan op de maag onder fysiologische omstandigheden mogelijk maakt. De implicaties van deze techniek breiden zich uit tot de ontwikkeling van therapieën voor de preventie of eliminatie van Helicobacter-infectie of de gevolgen ervan, met inbegrip van antibiotica, geneesmiddelen of vaccins.

Deze methoden geven inzicht dat specifiek is voor de pathogenese van Helicobacter-infectie. Een aantal van de technieken kan echter worden aangepast aan de studie van andere gastro-intestinale pathogenen. Over het algemeen, individuen nieuw op deze methode zal worstelen met de voorbereiding van een bacteriële entmateriaal in staat is tot vaststelling van een infectie bij muizen.

Het is absoluut noodzakelijk dat de Helicobacter isolaten bekende muiskoloniserende stammen zijn die geen uitgebreide subcultuur in vitro hebben ondergaan. Bovendien moet het aantal in vitro subculturen voor deze stammen worden geregistreerd. Voeg bacteriële suspensies toe aan 15-milliliter polystyreenbuizen en gebruik een plastic lus om een druppel van 10 tot 20 microliter van elke cultuur over te brengen op individuele glazen microscoopplaten.

Beoordeel vervolgens de levensvatbaarheid en beweeglijkheid van de bacteriën onder fasecontrastmicroscopie bij een 100 keer vergroting. Gebruik de H.pylori-inocula alleen als de meerderheid van de bacteriën een bacillaire vorm heeft. H.felis inocula moet voornamelijk spiraalvormige bacteriën bevatten.

En laad de inocula in individuele, wegwerp, een milliliter spuiten. Rust elke spuit uit met een naald van 23 meter en gebruik plastic paraffinefilm om een wegwerppolythyleenkatheter aan elke naald te bevestigen. Houd vervolgens handmatig een zes tot acht weken oude specifieke pathogene-vrije en Helicobacter-vrije muis bij de scruff van de nek en staart, en steek een katheter in het midden van de open kaak.

Leid de katheter in een staart naar de slokdarm, het uitbreiden van de nek van de muis om het gemak van de toegang tot de maag door de slokdarm en uit de buurt van de luchtpijp mogelijk te maken totdat de meeste of alle katheter niet meer zichtbaar is en een weerstand wordt gevoeld. Lever vervolgens minstens één keer 10 aan de vijfde bacterie om een optimale kolonisatie en ziektepathologie te garanderen. Gebruik aan het einde van het experiment een fijne, gebogen schaar om de buikholte te openen voor excisie van de maag.

Snijd de maag langs de grotere kromming, en voorzichtig wassen het orgaan twee keer in een 50-milliliter buis van verse PBS per wasbeurt om eventuele resterende voedsel te verwijderen. Na de tweede wasbeurt, plaats het weefsel in een bezoedelde, zes centimeter, plastic petrischaal om het natte gewicht op te nemen. Na het afvlakken van de maag, bisect het monster sagittally in twee gelijke weefselfragmenten bestaande uit het antrum, lichaam, en niet-kliernnomach regio's.

Verwijder het niet-kliergebied en weeg de helft van elke maag voordat u het stuk weefsel opslaat in de juiste oplossing voor de geplande downstream-analyse. Voeg de andere helft van het maagweefsel toe aan een 15-milliliter conische buis met 10% formaline, waardoor de weefsels na 10 seconden tegen de bovenzijde van de buizen worden afgevlakt. Wanneer de weefsels op de buiswanden zijn aangebracht, dompelt u de monsters gedurende ten minste 24 uur opnieuw onder in de formaline.

Om het aantal levensvatbare H.pylori in de maag na infectie te tellen, homogeniseren maagmonsters opgeslagen in BHI, en het uitvoeren van dubbele seriële verdunningen van de resulterende maaghomogenates in verse, steriele bouillon. Verdeel voorgedroogde paardenbloed agar, of HBA, platen aangevuld met extra antibiotica in drie of vier segmenten, en voeg, met behulp van een aanpassing van de Miles en Misra-techniek, 10 tot 100 microliter van elke maaghomogenate verdunning toe aan een segment van elke agarplaat. Verdeel de homogenaten met steriele, plastic lussen en laat de platen drogen.

Plaats vervolgens de platen in een omgekeerde positie in anaerobe gaspotten met een petrischaaltje water en een gasverpakking. Dan, incubeer de potten op 37 graden Celsius voor vier tot zeven dagen. Wanneer kolonies kunnen worden waargenomen, opsommen de segmenten met tussen de 10 en 100 geïsoleerde kolonies.

Na euthanasie wordt de maag geoogst van de dieren en gewogen. De niet-kliergebied wordt verwijderd, en de maag is verdeeld in twee gelijke helften bestaande uit het antrum en het lichaam. Succesvolle kolonisatie wordt meestal bevestigd door het uitvoeren van levensvatbare tellen en de daaropvolgende opsoming van individuele kolonies van maaghomogenates gestreept op HBA platen.

Merk op dat de aanwezigheid van vervuilende bacteriën uit de muis maagmicrobiota of grote aantallen H.pylori kolonies kan de opsommen van H.pylori CFUs compliceren. Als alternatief kan PCR worden gebruikt om infectie te verifiëren met behulp van specifieke gevalideerde primers gericht op een 325-base paar regio van de H.felis en H.pylori ureB genen. In dit representatieve experiment vertoonden wild-type C57 Black-6 muizen matige tekenen van ontsteking, waaronder hyperplasie en klieratrofie na zes maanden na infectie met H.felis, evenals cellulaire infiltratie van de submucosa.

Meer ernstige ontsteking wordt waargenomen in knock-out muizen op hetzelfde moment punt, met de extra aanwezigheid van lymfefoetjes waargenomen in de nabijheid van de cellulaire infiltreert. H.felis bacteriën kunnen ook worden gevisualiseerd in Giemsa-gekleurde delen van geïnfecteerde muis maagweefsel. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals kwantitatieve PCR, immunohistochemie of immunofluorescentie worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over de soorten gastheerreacties die tijdens de Helicobacter-infectie zijn geïnduceerd.

Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van microbiologie en gastro-enterologie om de veroorzakerrol van Helicobacter pylori bij maagziekte bij de mens te onderzoeken. Na het bekijken van deze video, moet u een goed begrip hebben van hoe muizen reproduceerbaar te infecteren met Helicobacter-soorten en de pathologie die met de infectie wordt geassocieerd te bestuderen. Vergeet niet dat de Helicobacter stammen gebruikt in dit protocol besmettelijk zijn, en daarom standaard bioveiligheid procedures moeten altijd worden gevolgd tijdens het werken met deze bacteriën.