Licht vel fluorescentie microscopie voor de studie van het lymfkliertest hart

Het belangrijkste voordeel van deze technologie is dat het zorgt voor een snelle beeldvorming van ofwel de muis hart. En het kan worden gebruikt om de aanwezigheid van luchtkanalen te observeren na gentherapie. Hoewel deze methode inzicht kan geven in ontwikkelingscardiologie, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals neurologie en longologie.

Over het algemeen zullen individuen worstelen met deze techniek, omdat het monteren van een beeldvorming van het volwassen muishart moeilijk kan zijn, en het is anders dan andere, traditionele technieken, zoals confocale en omgekeerde microscopie. Plaats een continue golflaser met drie golflengten van 405 nanometer, 473 nanometer en 532 nanometer. Breng vervolgens spiegel één aan en lijn deze uit met het spiegelvlak op 45 graden aan de balk.

Dit zal de laser naar de straalspleter leiden, die de dubbelzijdige verlichtingsopstelling vormt. Vervolgens passeert u de straal door een neutraal dichtheidsfilter met een diameter van 50 millimeter, een balk-uitvouwer en een speldengat met een diameter van 25 millimeter, allemaal 150 millimeter van elkaar geplaatst. Geef de balk door een 50-50 balk splitter, geplaatst 150 millimeter van het gaatje.

Plaats vervolgens twee 150 millimeter van de balkspl splitter, bij 90 graden naar de voorwaartse balk, en lijn deze uit zodat het spiegelvlak zich in een hoek van 45 graden naar de balk bevindt. Plaats vervolgens spiegel drie 100 millimeter van spiegel twee, en uitlijnen zodat het spiegel vlak is in een hoek van 45 graden aan de balk gereflecteerd van spiegel twee. Gebruik deze gereflecteerde straal om één kant van de dubbele verlichtingslichtplaat te vormen.

Aan de andere kant van de balk splitter, plaats spiegel vijf, zodat het spiegel vlak is op 45 graden aan de balk die wordt uitgezonden in een voorwaartse richting. Gebruik de straal die van spiegel vijf wordt uitgezonden om de tweede zijde van het dubbele verlichtingslichtblad te vormen. Zet vervolgens het dubbelzijdige verlichtingssysteem systemisch op.

Plaats cilindrische lens twee 150 millimeter uit de buurt van spiegel drie, en een andere identieke cilindrische lens 150 millimeter uit de buurt van spiegel vijf, aan de andere kant van de dubbele verlichting setup. Plaats vervolgens twee spiegels, elk in lijn met de cilindrische lenzen, op afstanden van 50 millimeter om de balk op 90 graden te reflecteren. Aan beide zijden van de lichtplaat, vormen een achromatische doublet van een paar lenzen, met de eerste lens wordt geplaatst 100 millimeter van de vorige spiegel, en met een diameter van een inch en een brandpuntsafstand van 100 millimeter.

De tweede lens moet worden geplaatst 160 millimeter van lens een, met een diameter van een inch, en een brandpuntsafstand van 60 millimeter. Plaats vervolgens de verlichtingsdoelstellingen één en twee 150 millimeter van de vorige achromatische doubletten, zodat ze in lijn zijn met de balk. De straal die uit de doelstellingen wordt uitgezonden, vormt de lichtplaat voor het beeldvorming van de monsters.

Bereid eerst het fluorescerende kraalmonster voor door een 0,53 micrometer kraaloplossing, één tot 150.000, te verdunnen in een voorverwarmde refractieve indexmatchingoplossing, met een procent lage smeltmoer. Gebruik vervolgens een stuk borosilicaat glazen buizen met een binnendiameter van 12 millimeter, en een buitendiameter van 18 millimeter, tot een lengte van 30 millimeter. Pipette de kraal agarose oplossing in de borosilicaat buizen en laat de agarose te stollen bij kamertemperatuur.

Vul nu een 3D-geprinte ABS-kamer met een gylceroloplossing van 99,5 procent. Plaats de borosilicaat glazen buizen, met de kralen, in de kamer. Bevestig een 3D gemotoriseerde translationele fase aan de borosilicaat glazen buizen om de beweging en oriëntatie van het monster in de ABS-kamer te controleren.

Gebruik vervolgens op maat ontworpen software om afbeeldingen te verkrijgen met behulp van de sCMOS-camera, met een snelheid van 30 frames per seconde. Met behulp van de motorcontroller verplaatst u het monster een millimeter in de zijrichting en verwerft u beelden bij elke toename van één millimeter, totdat het hele monster is afgebeeld. Stapel de verkregen afbeeldingen met behulp van een visualisatiesoftware en meet de puntspreadfunctie van het systeem met behulp van deze kraalafbeeldingen.

Gebruik een refractieve index matching oplossing, met een pH van 7,5, en los een procent agarose in de bijpassende oplossing. Plaats een gewist volwassen muis hart monster in de brekingsindex matching oplossing, met een procent agarose opgelost. Steek vervolgens het monster in de glazen buizen van borosilicate en laat de agarose stollen bij kamertemperatuur.

Bevestig een 3D gemotoriseerde translationele fase aan de borosilicaat glazen buizen om de beweging en oriëntatie van het monster in een 3D-geprinte ABS-kamer te controleren. Plaats het monster zo dat het zich in het midden van de Gaussische balk bevindt, gecreëerd door het dubbele verlichtingssysteem. Stel vervolgens de aanschafsnelheid van de sCMOS-camera in op 30 frames per seconde.

Nu, met behulp van de motor controller, verplaats het monster een millimeter in de axiale richting en het verwerven van beelden op elke een millimeter toename. Ga door totdat het hele voorbeeld is afgebeeld. Stapel de verkregen afbeeldingen met behulp van een visualisatiesoftware.

Ontwikkel de 3D-afbeeldingen met behulp van deze afbeeldingsstapels. Om dit te bereiken, deconvolve de punt spread functie eerder bepaald, en gebruik het voor de verworven afbeelding stapels. Stel ten slotte een pixeldrempelintensiteit in om de contouren van het hart te observeren en voeg pseudo-kleur toe aan de afbeeldingen, op basis van deze intensiteit van de grijsschaal.

Op dag één postnatale, kan men visualiseren de kleppen, atrium, ventrikel, pectinate spier, en trabeculatie, onder andere functies. Op dag zeven postnatale, de functies zijn nog meer gedefinieerd. Het atrium, ventrikel, ventriculaire spouwafmetingen en ventrikelwanddikte zijn allemaal duidelijk.

Om cardiomyocyte differentiatie in het hart te bestuderen, werden heterozygoot-in muizen cre-gelabeld om cardiomyocyten te tonen. De gelabelde cellen worden hier weergegeven, in elke richting van het vlak. De drie vliegtuigen werden samengevoegd, om een 3D-weergave van het hart te creëren.

Het rode omcirkelde gebied binnen de inzet toont twee doorschijnende muisharten na het ondergaan van de helderheidstechniek en wordt in de borosilicaatglazenbuis geplaatst. Naast het bestuderen van postnatale muizen, kan het beeldvormingssysteem ook worden gebruikt om het volwassen muizenhart te bestuderen. Hier worden GFP-gecodeerde ROMK-kanalen getoond na 7,5 maanden.

Deze werden voornamelijk gevonden in de ventriculaire muur. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek worden gedaan in een tot twee minuten. Bij het proberen van deze procedure is het belangrijk om alle bellen rond het monster in de buis te verwijderen.

Andere methoden, zoals automatische segmentatie van de beeldstapels, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen met betrekking tot cardiovasculaire schade en regeneratie te beantwoorden. Na de ontwikkeling werd deze techniek door onderzoekers gebruikt om de hartarchitectuur te bestuderen in postnatale en volwassen ontwikkelingsstadia bij muizen.