Amostragem Microbiopsy absorvente e extração do RNA para sangue minimamente invasiva, simultânea e análise de pele

Esse método pode facilitar o estabelecimento de biomarcadores para doenças de pele e também reduzir o risco para os participantes da pesquisa clínica. As principais vantagens dessa técnica são que ela não requer treinamento intensivo e não deixa cicatrizes. Cinco minutos antes da microbiopsia, coloque um tubo vazio de dois mililitros em gelo seco por cinco minutos.

Usando luvas descartáveis, pulverize as mãos e ferramentas com 70% de etanol antes de higienizar o local de aplicação sobre o assunto com um lenço de álcool. Remova a micro biópsia do pacote de radiação gama esterilizada sem tocar no microacle e puxe o êmbolo até que um clique seja ouvido e o êmbolo se triva no lugar. Aponte o dispositivo carregado em um ângulo aproximadamente perpendicular à pele a ser amostrado, tendo em conta que a área de amostragem esteja em posição fixa e aplique o dispositivo na pele dentro de pelo menos um quilo de força.

Em seguida, pressione o gatilho e mantenha o dispositivo no lugar por pelo menos dez segundos. Se o dispositivo for liberado antes de dez segundos, há uma maior chance de variação na absorção de sangue e também na análise subsequente. Quando a amostra tiver sido absorvida, puxe suavemente o êmbolo e o microacle absorvente da caixa e use fórceps estéreis para puxar os dois orifícios do microacle para removê-lo do êmbolo.

Adicione 50 microliters de tampão de extração ao tubo em gelo seco e coloque o microagulha intacto no tubo no lado seco da agulha de gelo para baixo. Tenha cuidado para não deixar a ponta do microaclese tocar em nada durante o processo de remoção. Vórtice do tubo por três a cinco segundos para coletar algum material amostrado da ponta do microacleto e incubar o tubo em um bloco de calor ou banho de água por 30 minutos a 42 graus celsius.

No final da incubação, use fórceps estéreis para colocar a extremidade traseira do nível do microaclese com a borda superior do tubo de microfuge e fechar a tampa do tubo de tal forma que a parte superior do microacle é mantida no lugar entre a tampa e o tubo. Centrifugar o tubo para coletar o material amostrado da camada absorvente do dispositivo e usar os fórceps para remover cuidadosamente o microacle sem mergulhar a ponta de volta na solução tampão. Centrifugar a amostra novamente e transferir cuidadosamente o supernante para um novo tubo de micro centrífuga.

Em seguida, adicione 250 microliters de tampão de condicionamento em uma membrana de filtro de coluna de purificação para uma incubação de cinco minutos à temperatura ambiente e dilua o buffer por centrifugação. Adicione 50 microliters de 70% de etanol à amostra de RNA extraída com mistura suave e transfira a mistura para a coluna de purificação pré-condicionada. Imediatamente centrifufique o tubo duas vezes para remover o fluxo- through, seguido por uma lavagem em cem microliters de tampão de lavagem um.

Para digestão de DNA, adicione 40 microliters de incubação de DNAs recém-preparada mistura diretamente na membrana da coluna de purificação para uma incubação de 15 minutos à temperatura ambiente, seguida por uma lavagem com 40 microliters de tampão de lavagem um. No final da centrifugação, lave a coluna com 100 microliters de tampão de lavagem dois e verifique a coluna de purificação para qualquer tampão de lavagem residual. Transfira a coluna de purificação em um tubo de micro centrífuga de 0,5 mililitro fornecido no kit de extração de RNA e coloque a ponta da pipeta diretamente na membrana da coluna de purificação para adicionar 11 microliters de água RNA sPRE à coluna.

Após uma incubação de dois minutos à temperatura ambiente, centrifufique a coluna uma vez para distribuir a água RNA sPRE em toda a coluna, e uma vez para elutar o RNA. Em seguida, armazene a amostra total de RNA a menos 80 graus celsius se a síntese de CDNA não for realizada imediatamente. A microaclesia absorvente consiste em duas camadas de chapa de aço com uma camada absorvente entre elas para amostragem simultânea da pele e sangue.

O uso de uma microbiopsia absorvente induz apenas eritema menor, que não é perceptível após 48 horas. Após a punção, alguns pequenos pedaços de pele são capturados perto da ponta do microapós e o sangue é absorvido no papel filtro. Quando o microacle absorvente é removido imediatamente após a punção, o volume amostral e a quantidade subsequente de mRNA extraído é significativamente menor do que o obtido após a retenção por dez segundos após a punção.

Níveis semelhantes de expressão de marcador de pele são detectados após o uso de microbiopsia absorvente e sua microbiopsia de pele antecessora por análise quantitativa de PCR. Mas um nível significativamente maior de expressão de biomarcadores de glóbulos brancos é detectado após amostragem de microbiopsia absorvente, sugerindo que o microabiopso absorvente tem melhor desempenho para coleta de sangue, mantendo a mesma capacidade de captura de amostras de pele como com a microbiopsia da pele. Assim, ao aplicar a técnica, é crucial lembrar que aplicar o dispositivo de acordo com o que sugerimos é essencial para obter resultados confiáveis.

Assim, seguindo este procedimento, outros métodos, como PCR em tempo real, podem ser seguidos para perfis relativamente gênicas de expressão genética. Embora ainda estejamos desenvolvendo o dispositivo, estamos confiantes de que a técnica abriu caminho para pesquisas clínicas para a realização de amostragem, para aplicação cosmética dermatológica ou pediátrica, pois é tão simples e minimamente invasiva.