遺伝子療法ポリカチオン コーティングに影響を与えた DNA 折り紙ナノ構造体の保護

DNAナノ構造体の生物学的安定化は、標的薬物送達などの将来のインビボ用途に不可欠です。しかし、DNAは様々な酵素によって体内で分解されます。ここでは、酵素分解からDNAナノ構造体を保護するコーティング技術を紹介します。

主な利点は、我々のコーティングは、すでに生物に使用されている非毒性化合物を含み、表面の機能化が可能なままであるということです。この機能化は、ターゲット認識のための分子センサーと、医薬品貨物放出用のスイッチを組み込むために重要です。ポリカチエーションコーティングは、カプセル化されたDNA折り紙構造の細胞取り込みが著しく増加するため、この方法は診断および治療におけるDNAオリガミスの適用のための扉を開くことができます。

細胞の取り込みは、DNAナノテクノロジーの潜在的な遺伝子送達用途にも必要です。私は、この方法は非常に簡単で、簡単に習得できると考えています。まず、精製されたDNA折り紙の濃度を測定する。

紫外線分光光度計を校正するために、ブランクとして2マイクロリットルのTBバッファーを使用してください。そして、260ナノメートルでDNA折り紙濃度を測定します。次に、精製されたDNA折り紙溶液中のリン酸塩の量を、原稿に記載されているように式2を用いて計算する。

1つのナノモルのリン酸塩を含み、希釈用の結核バッファーを用いて、DNA折り紙構造の15マイクロリットルを調製する。13.2マイクロリットルを1.8マイクロリットルのキトサンにTBに加えます。そして、15マイクロリットルのDNA折り紙にキトサン溶液を15マイクロリットル加え、N/P比8のDNA折り紙キトサンポリプレックスを開発する。

原稿に記載されている計算を使用して、異なるN/P比のポリプレックスを準備し続けます。2%アガロースゲルのためのチューブの80ミリメートルを調製します。塩化2.5モルの塩化マグネシウム352マイクロリットルを加え、10マイクロリットルのDNAゲル染色で予染色します。

乾燥したゲルボックスにゲル溶液を注ぎます。ゲル電気泳動コームを挿入し、室温で15〜30分間固めます。一方、11ミリモル塩化マグネシウムでランニングバッファを補います。

各サンプルの10~20マイクロリットルを6Xの負荷バッファの20%と混合します。コントロールとして裸のDNA折り紙を含むアガロースゲルウェルにサンプルをロードします。ゲルを室温で70ボルトで2時間半から3時間動かします。

次に、UV スキャナを使用してゲルを視覚化します。DNase I保護アッセイを実行するには、異なるN/P比で比較した各ポリプレックスの4マイクロリットル、10X DNase Iバッファーの1.5マイクロリットル、8マイクロリットルの結核、および1.5マイクロリットルのDNase Iを別々の2ミリリットルPCRチューブに加えます。その後、サーモサイクラーで摂氏37度で同じを24時間インキュベートします。

DNase Iを消化するには、1ミリリットル当たり20ミリグラムの2マイクロリットルをプロテナーゼKに加え、サーモサイクラーで摂氏37度で30分間インキュベートします。次いで、コアDNAナノ構造体を解明するために、1ミリリットル当たり50ミリグラムの3.6マイクロリットルを40キロダルトンデキストラン硫酸塩を添加する。次に、これらのサンプルと新鮮なDNA折り紙を制御として使用し、前述のようにアガロースゲル電気泳動を行う。

ゲルからロードされたサンプルに対応するバンドを物品化します。DNA折り紙を抽出するには、スクイーズ凍結抽出カラムを使用し、製造業者の指示に従い、原稿に記載されているように負の染色透過電子顕微鏡イメージングを続けます。精製された36ナノモルHRP-NRの6.5マイクロリットルを、様々な濃度のポリカチ処理の6.5マイクロリットルと混合します。

1、2、4、10、および20のN/P比でポリプレックスを調製するには、6.5マイクロリットルの蒸留水を、1、2、4、10、および20のN/P比に対応する様々な濃度のポリカレーションの6.5マイクロリットルを混合してブランク基を調製する。次に、これらの調製された溶液のそれぞれ12.5マイクロリットルを96ウェルプレートの別々のウェルに加えます。その後、各ウェルにHEPESバッファーの72.5マイクロリットルを追加し、混合します。

15ミリモルABTSの10マイクロリットルを加え、12ミリモル過酸化水素を5マイクロリットルずつ各ウェルに加え、上下にピペットで混ぜます。最後に、マルチモードプレートリーダーを使用して、4時間にわたって421ナノメートルの吸光度を測定します。ゲル遅延アッセイを用いてポリプレックスを解析した後、ポリケーションに結合する際のリン酸基の負電荷の逆平衡化と複合体のサイズ増加により、裸のナノ構造が陰極に向かってシフトした。

余分な量のポリアニオン(硫酸デキストランなど)を添加した場合、ポリプレックス形成が逆転した。より高分子量のデキストラン硫酸は、より低分子量に比べてより効率的であることが示された。負の染色透過電子顕微鏡を用いてポリプレックスを分析した後、顕微鏡写真は、裸のDNA折り紙ナノ構造、脱カプセル化後の線形ポリエチレンイミンポリプレックス、キトサンポリプレックス、裸で保護されたDNA折り紙の画像をマグネシウム枯渇、酵素分解、血清消化を示した。

DNase Iの存在下では、2時間後に裸のナノ構造が完全に消化されたのに対し、キトサン封入DNA折り紙の直鎖ポリエチレン化ポリプレックスは、1ミリリットル当たり10単位のDNase I.Linearポリエチレンイミンポリプレックスの存在下でそのまま残り、キトサンと比較してより効率的にDNAナノ構造を保護した。ポリプレックスのN/P比が大きくなると、DNA消化が低くなった。酵素をコーティングした後、またはより機能的なDNA折り紙の後、変異型N/P比で直鎖状ポリエチレン化ポリプレックスおよびキトサンを有し、酵素活性に顕著な干渉は認められなかった。

一方、HRP酵素の動態はDNA折り紙に結合した後に劇的に変化した。よく精製されたDNA折り紙構造から始めるのが重要です。ポリカチにも結合できる安定したストランドが存在する。

それらはDNA折り紙ポリプレックスから分離することは困難である。当社のコーティング分子は、遺伝子治療用途にも使用されています。これは、DNAナノ構造が将来、生物のゲノムを改変するために使用できることを意味します。

アガロースゲル染色の場合、通常、DNAをインターカレートする分子が使用され、変異原性を有する可能性がある。DNA染色の際は、研究室の安全指示に従ってください。