Выделение субпопуляций адипогенных и фибровоспалительных стромальных клеток из внутрибрюшных жировых депо мышей

Протокол позволяет исследователям выделять функционально и молекулярно различные субпопуляции стромальных клеток перигонадальной белой жировой ткани из интересующих мышиных моделей. Преимущество данной методики в том, что все инструменты и реагенты широко доступны. Демонстрировать процедуру будет Лаванья Вишванатх, старший аналитик по лабораторным исследованиям из лаборатории доктора Раны Гупты.

После выделения стромальных сосудистых клеток из гонадной белой жировой ткани, или WAT, ресуспендируйте клеточную гранулу в одном миллилитре буфера для лизиса эритроцитов в течение одной-двух минут инкубации при комнатной температуре. Остановите лизис с помощью 10 миллилитров 2% FBS и PBS и отфильтруйте клетки через сетчатый фильтр для клеток 40 микрон в новую центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров. Соберите клетки центрифугированием и повторно суспендируйте гранулу в дозе от 400 до 800 микролитров FBS и PBS, дополненную блоком FC.

После 10-минутной инкубации при четырех градусах Цельсия перенесите от 400 до 800 микролитров клеток в соответствующее количество пробирок для окрашивания флуоресцентно-конъюгированными антителами и пометьте клетки контрольными и экспериментальными антителами при температуре четыре градуса Цельсия в течение 15 минут, защищенных от света. По окончании инкубации гранулируйте клетки методом центрифугирования и промойте клетки в 400 микролитрах свежих FBS и PBS на пробирку. После промывки повторно суспендируйте гранулы в 400-800 микролитрах свежих FBS и PBS на пробирку и отфильтруйте ячейки через фильтрующие колпачки 40 микрон в пятимиллилитровые полистирольные пробирки с круглым дном для FACS.

Установка компенсационных и экспериментальных ворот для получения антигенпрезентирующих клеток и фибровоспалительных предшественников. После сортировки клеток соберите и промойте клетки центрифугированием, а также повторно суспендируйте гранулы в 500 микролитрах среды для клеточной культуры, представляющей гонадный антиген, на фракцию. Для отделения иммуномагнитных шариков адипогенной и неадипогенной клеточных фракций ресуспендируют стромальную сосудистую гранулу в 10 миллилитрах буфера МС и фильтруют клетки через сетчатое фильтр 40 мкм.

После подсчета соберите клетки центрифугированием и ресуспендируйте клетки в соотношении не более чем на один раз от 10 до восьмой клетки на миллилитр концентрации буфера МС. Затем добавьте не более 0,25 грамма биотин-конъюгированного антитела против CD31 и анти-CD45 в расчете один умножить на десять к шести клеткам для 15-минутной инкубации на льду. В конце инкубации промойте клетки в четырех миллилитрах буфера МС путем центрифугирования, и повторно суспендируйте гранулу в 100 микролитрах свежего буфера МС.

Добавьте в клетки 10 микролитров наногранул стрептавидина для 15-минутной инкубации на льду с последующей еще одной промывкой в четырех миллилитрах буфера для МС. Ресуспендируйте гранулу в 2,5 миллилитрах свежего буфера MS и перенесите клетки в пятимиллилитровую полипропиленовую трубку. Поместите пробирку на магнит на пять минут, прежде чем сцеживать непомеченные клетки в новую центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров.

Повторите промывку еще два раза, как показано на рисунке, вытягивая немеченые клетки после каждой промывки, и соберите истощенные эндотелиальными и гемопоэтическими линиями клетки с помощью центрифугирования. Ресуспендируйте гранулу в 100 микролитров буфера MS и пометьте клетки не более 0,25 микрограммами антител Ly6C и CD-9 в расчете на 10 10 из шести клеток на 15 минут на льду. В конце инкубации соберите несвязанные Ly6C-отрицательные CD-9-отрицательные адипогенные клетки, как было показано выше, прежде чем собирать Ly6C-положительные неадипогенные клетки.

Затем соберите обе клеточные популяции методом центрифугирования и ресуспендируйте клетки в 500 микролитрах среды для клеточной культуры, представляющей гонадный антиген, на фракцию. Чтобы настроить клеточные культуры для дифференцировки, поместите каждую фракцию в четыре раза по 10 четвертых клеток на лунку в концентрации в отдельных лунках 48-луночного планшета для культивирования и поместите планшеты в инкубатор для клеточных культур на срок от 7 до 10 дней. Клетки-предшественники адипоцитов начнут подвергаться дифференцировке в адипоциты по мере приближения к слиянию, в то время как предшественники воспаления фиброина будут устойчивы к адипогенезу.

Используя этот протокол, можно выделить отдельные популяции стромальных клеток из внутрибрюшных депо WAT взрослых мышей с помощью FACS или иммуномагнитного разделения шариков, как это было продемонстрировано. С помощью иммуномагнитного разделения шариков адипогенные и неадипогенные клетки могут быть выделены из стромальной васкулярной фракции гонады WAT. По данным проточной цитометрии, 75% клеток в пределах адипогенной фракции являются Ly6C-отрицательными CD-9-негативными адипоцитарными клетками-предшественниками, в то время как более 75% клеток неадипогенной фракции являются Ly6C-положительными фибровоспалительными клетками-предшественниками.

Клетки-предшественники адипоцитов, выделенные любым из этих методов, дифференцируются в липидсодержащие адипоциты до высокой чистоты в течение 7-10 дней после осаждения. Напротив, неадипогенные предшественники остаются фибробластоподобными и не становятся адипоцитами в тех же условиях культивирования. Протокол предназначен для выделения субпопуляций адипогенных и фибровоспалительных стромальных клеток из перигонадной белой жировой ткани.

Подобные клеточные популяции можно найти и в других жировых депо мышей. Однако их подбор будет зависеть от использования разных антител. Клеточные популяции, выделенные с помощью FACS и магнитной сепарации, могут быть использованы для анализа дифференцировки клеток in vitro или дополнительно охарактеризованы с помощью анализа экспрессии генов.