Plastoglobule Lipid Droplet Isolation van plantaardig bladweefsel en cyanobacteriën

De isolatie van zeer zuivere plastoglobulen is van cruciaal belang voor hun studie. Een snel en effectief protocol voor hun isolatie dat hun downstream biochemisch onderzoek vergemakkelijkt, wordt hier gepresenteerd. Het belangrijkste voordeel van deze methode is de relatieve snelheid van de procedure en het aanpassingsvermogen aan tal van plantensoorten en omgevingsomstandigheden.

Bij het soniceren van thylakoïde resuspensaties moet bijzondere aandacht worden besteed aan voldoende kracht om plastoglobulen uit thylakoïden te verwijderen en bij de daaropvolgende extractie van plastoglobulen uit sacharosegradiënt. Dr. Elsinraju Devadasu, een postdoctoraal onderzoeker in mijn laboratorium, en Febri Susanto, een promovendus in mijn laboratorium, zullen deze procedure demonstreren. Begin met het verwerven van drie weken oude zaailingen van zes gezonde maïs, met een V5-groeistadium en een gewicht van ongeveer 120 gram.

Knip alle bladeren aan de basis van de stengel af en dompel ze snel in een ijsbad voordat je ze naar de koelcel transporteert. Werk onder een groene veiligheidslamp, verwijder de maïsbladeren uit het ijsbad en knip ze met een schaar in kleinere stukjes van vijf bij vijf centimeter. Maal voorzichtig en grondig de helft van het geknipte bladweefsel in 350 milliliter van de maalbuffer op een niveau lager dan zeven op een commerciële blender.

Start en stop de blender vijf tot zes keer om ervoor te zorgen dat alle bladeren worden gesneden. Filtreer het homogenaat door een laag nylondoek van 25 micron op een grote trechter tot vier centrifugeflessen van 250 milliliter. Nadat u de mengstap met het resterende geknipte bladweefsel hebt herhaald, verdeelt u het filtraat gelijkmatig over de vier flessen.

Verwijder een aliquot van het bladfiltraat en leg het apart om te worden bewaard als een representatief totaal bladmonster. Centrifugeer vervolgens het filtraat gedurende zes minuten bij 1, 840 G en vier graden Celsius. Giet het resulterende supernatant af en resuspenseer met zachte wervelende bewegingen van de borstel de pellet in 12 milliliter medium R 0,2, met 0,2 molaire sucrose.

Nadat u de pellet in één fles hebt geresuspendeerd, voegt u de suspensie toe aan de volgende fles en herhaalt u de resuspensie om de suspensies in één fles te bundelen. Verdeel de gepoolde suspensie over zes ultracentrifugebuizen van drie milliliter, waarbij een maximaal volume van 2,5 milliliter in elke buis wordt bereikt. Gebruik vervolgens de tip sonicator met een amplitude van 100% om elke buis vier keer gedurende 10 seconden te soniceren.

Zorg ervoor dat de sonicatorhoorn ondergedompeld blijft en uit de buurt van het vloeibare oppervlak om schuimvorming te voorkomen. Beweeg de sonicatorhoorn langzaam op en neer in de ophanging tijdens elke ronde. Terwijl u de vier buizen afwisselt, brengt u elke buis na elke ultrasoonapparaat terug naar een ijsemmer om het monster te laten afkoelen.

Als u klaar bent, centrifugeert u de gesonificeerde ruwe thylakoïde suspensie bij 150.000 G gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Scheer het kussenoppervlak af met een spuit en een naald van 22 gauge en oogst het resulterende gele en olieachtige drijvende pad van ruwe plastoglobules uit het sucrosekussen. Herstel ongeveer 500 microliter uit elke buis en deponeer ze in een buis van 2,0 milliliter.

Verzamel ruwe thylakoïde aliquots voor en na de ultrasoonapparaat en afgifte van plastoglobulen. Als u klaar bent, gaat u verder met de verwerking van het plantenweefsel of slaat u de ruwe plastoglobulen op bij min 80 graden Celsius en zuivert u ze later. Kweek 50 milliliter synechocystis-soorten PCC 6802-cultuur in BG11-media gedurende 7 tot 10 dagen om de stationaire fase te bereiken.

Stel met behulp van een spectrofotometer de celdichtheid in op een optische dichtheid van 2,0 op 750 nanometer. Om de polysacchariden te verwijderen, centrifugeer 50 milliliter cultuur en verwijder het supernatant. Herhaal het wassen van de cellen in 50 milliliter buffer A twee keer.

Resuspendeer de gewassen pellet in 25 milliliter buffer A en breek de cellen met behulp van een Franse drukcel op 1, 100 pond vierkante inch. Herhaal het proces drie keer in koude omstandigheden totdat de gelyseerde kleur verandert van groen naar rood, blauw, groen onder wit licht. Verwijder het aliquot van het celhomogenaat en leg het apart om te worden bewaard als een representatief totaalcelmonster.

Verdeel het resulterende homogenaat in acht ultracentrifugebuizen van drie milliliter gevuld tot maximaal 2,5 milliliter in elke buis. Leg dit homogenaat over elkaar met 400 microliter medium R, waardoor een stapgradiënt ontstaat. Balanceer de buizen zorgvuldig door indien nodig extra medium R toe te voegen voordat u de buizen centrift.

De thylakoïde en andere zwaardere organellen, inclusief polyhydroxyalkanoaatlichamen, vertonen pelletvorming, terwijl plastoglobulen een gele olieachtige pad vormen op of nabij de bovenkant van de sucrosegradiënt. Oogst de resulterende drijvende pad van ruwe plastoglobules met een spuit, zoals eerder aangetoond, en deponeer de oogst in een buis van twee milliliter. Schraap plastoglobulen van de zijkant van de ultracentrifugebuiswand indien nodig met een naaldpunt.

Ga verder met de verwerking van cyanobacteriën of bewaar ruwe plastoglobulen bij min 80 graden Celsius en zuiver later. Om de zuivere plastoglobulen te oogsten met behulp van de verwerkingsmethode voor plantenweefsel, bereidt u de sucrosegradiënt die eerder is beschreven met behulp van 500 microliter ruwe plastoglobulen, 400 microliter medium R 0,2 en 400 microliter medium R.Na centrifugatie oogst u het resulterende drijvende pad van pure plastoglobules in een buis van twee milliliter. Na het aliquoteren van de zuivere plastoglobules en het flashvriezen van de aliquots in vloeibare stikstof, bewaar je ze bij min 80 graden Celsius of lyofiliseer je ze tot een droog poeder.

Om zuivere plastoglobulen uit cyanobacteriën te oogsten, creëert u een sucrosegradiënt, zoals eerder vermeld, met behulp van 500 microliter van de ruwe plastoglobulen, 750 microliter medium R 0,7 en 750 microliter medium R 0,2. Verzamel na centrifugatie de zuivere plastoglobulen in een buis van 1,5 milliliter en aliquot de zuivere plastoglobulen. Als u klaar bent, bevriest u de zuivere plastoglobules aliquots in vloeibare stikstof en slaat u ze direct op bij min 80 graden Celsius of lyofieliseert u tot een droog poeder.

Bij deze methode werd een aanzienlijke hoeveelheid plastoglobule of lipidedruppelmateriaal gezien dat op de bovenste laag van het sucrosekussen dreef. Na daaropvolgende centrifugatie werden gezuiverde plastoglobulen verkregen op of nabij het oppervlak van de sucrosegradiënt. Na de succesvolle isolatie van plastoglobules toonden immunoblots ontwikkeld voor zuiverheidsbeoordeling met behulp van antilichamen tegen arabidopsis thaliana fibrilline 1a en arabidopsis thaliana fotosysteem II subunit D1 aan dat de fibrilline homologen voornamelijk geassocieerd waren met thylakoïden dan de plastoglobulen.

Om de efficiënte en geconcentreerde extractie van de zwevende pad te garanderen, plaatst u de naaldopening van de spuit net onder het vloeibare oppervlak van de buffer terwijl u volledig ondergedompeld bent en trekt u vervolgens voorzichtig omhoog. Geïsoleerde plastoglobulemonsters zijn vatbaar voor latere proteomische of lipidomische studies en zijn gebruikt om de veranderingen in de beoogde eiwit-lipidesamenstelling onder verschillende omgevingsomstandigheden aan te tonen. Deze techniek heeft nieuwe studies van de plastoglobule vergemakkelijkt, waaronder de ontdekking van geassocieerde eiwitkinaseactiviteit en de aanwezigheid van oligomere eiwitcomplexen door middel van daaropvolgend biochemisch onderzoek.