Isolatie en analyse van de samenstelling van de Plant Nagelriem Lipid Polyester Monomeren
November 22nd, 2015
Lipide polyesters vormen de structurele componenten van twee celwandmodificaties, de plantencuticula en suberine-bevattende diffusiebarriers. In deze video beschrijven we een methode om cutine te depolymeriseren uit volledig ontvette bladeren. De methode kan worden toegepast op het onderzoeken van mutanten die beperkt zijn in de biosynthese van cutine of suberine.
Vasculaire planten zijn afhankelijk van extracellulaire lagen die fungeren als waterdichte barrières tussen plantweefsels en de externe omgeving. Deze lipofiele cellen, hoewel geassocieerde structuren, beperken pathogene infectie en reguleren de passieve transport van gassen, water en opgeloste stoffen in en uit plantweefsels. Een belangrijke barrière is de plantcuticula, een complexe structuur die uniek is voor planten.
Cutine is een onoplosbaar glycerollipide polyester dat de structurele matrix van de cuticula vormt en is geassocieerd met in oplosmiddel uittrekbare wassen. Hier presenteren we een betrouwbare techniek om de samenstelling van lipide polyesters te meten en de lipide plantweefsels te houden. In dit protocol worden gehele weefselmonsters geoogst, gehomogeniseerd en uitputtend, vervallen door een reeks oplosmiddelextracties om oplosmiddeloplosbare lipiden te verwijderen, inclusief cuticulaire en epi-particulaire wassen.
Triglycerol in membraanlipiden. Vervolgens worden monsters gedepolymeriseerd in hun component lipide monomeren door natriummethoxide gekatalyseerde methyl lyse. Simulatie reagentia worden toegevoegd om hydroxylgroepen om te zetten in hun overeenkomstige trimethylcellderivaten die geschikt zijn voor gaschromatografische analyse.
De derivaatresten worden vervolgens overgebracht naar GC-buisjes en geladen in A-G-C-M-S voor analyse, waardoor een chromatogram wordt gegenereerd dat de monomere samenstelling van biopolyesters karakteriseert. Aanwezig in geëxtraheerde monsters. Hier oogsten we hele bladmonsters van wild type en twee mutanten van volwassen arabidopsis ANA-planten.
Voor extractie en analyse, voeg 0,5 gram weefsel toe aan schone glazen buisjes die vooraf zijn gespoeld met chloroform. Plaats 100 milliliter isopropanol in een kolf en voeg gebutyleerde hydroxytolueen toe tot een concentratie van 0,01%. BHT is een antioxidant die wordt toegevoegd om dubbele bindingen en vetzuren te beschermen tegen oxidatie tijdens oplosmiddelextracties. Verwarm het oplosmiddel in een waterbad voor tot ongeveer 85 graden.
Voeg 25 milliliter verwarmd isopropanol per gram plantenweefsel toe en incubeer de monsters in de hitte LOC gedurende 15 minuten op 85 graden. Laat de buisjes afkoelen tot kamertemperatuur en met oor- en oogbescherming. Maal ten slotte de monsters met een homogenisator om een homogene dispersie te verkrijgen, sluit de buisjes met schroefdoppen en schud ze 100 RPM gedurende één tot twee minuten. Centrifugeer de monsters bij 800 G gedurende 10 minuten.
Om de organische fase te scheiden van de materialen met hogere dichtheid die in het pellet zijn gecompacteerd, verwijder en gooi het supernatant weg met behulp van een Pasteur of propent. Zorg ervoor dat je het pellet niet verstoort. Voeg een gelijk volume isopropanol toe bij kamertemperatuur en schud de monsters gedurende de nacht.
Centrifugeer de monsters bij 100 RPM en gooi het supernatant weg. Ik voeg 25 milliliter van een twee-op-een-oplossing van chloroform, methanol, toe per gram weefsel en schud de monsters gedurende de nacht. Centrifugeer en gooi de organische fase weg. Herhaal vervolgens dit proces met een één-op-twee chloroform-methanoloplossing.
Laat de pellet een nacht drogen en breng de buisjes van de afzuigkap over naar een vacuüm droogmiddel dat anhydrisch calciumsulfaat bevat om de monsters gedurende ten minste drie dagen of totdat een constante massa is bereikt, te dehydrateren. Zodra de monsters grondig zijn gedroogd, zijn ze klaar voor defloreer door natriummethoxide gekatalyseerde metalyse. Voeg twee oplossingen van interne standaarden toe aan buisjes met droge weefsels met behulp van een glazen spuit, beginnend met 25 microliters methyl HETO decanoaat en 25 microliters omega pentec en lacton.
Om diepe polymerisatie te initiëren, voeg 0,9 milliliter methylacetaat toe aan monsters, gevolgd door 1,5 milliliter natriummethoxide katalysator en 3,6 milliliter methanol. Incubeer monsters gedurende twee uur bij 60 graden met periodiek vortexen binnen het reactiesysteem, lipide polyesters reageren met nucleofiele methoxide anionen om onstabiele tetraëdrische tussenproducten te vormen, die gemakkelijk dissociëren in vetzuur, methyl esters en een oxide anionen. Deze oxiden zijn geconjugeerde basen en reageren met methanol om de katalytische actieve meth IDE anionen te regenereren, waardoor aanvullende diepe polymerisatiereacties worden ondersteund.
Als er water in het systeem aanwezig is, zal het reageren met natriummethoxide om natriumhydroxide te vormen. Een sterke base die polyesters onomkeerbaar omzet in ongewenste vrije vetzuren. In plaats van fa om hydrolyse te voorkomen, wordt methylacetaat toegevoegd om alle natriumhydroxide in het systeem te verwijderen.
Laat de buisjes afkoelen tot kamertemperatuur. Na incubatie, extraheer de monomeren door 10 milliliter methyleendichloride toe te voegen aan elke buis. Voeg vervolgens 1,5 milliliter glaszuur toe om de monsters aan te zuurzen.
Vul de buisjes met 0,5 molaire natriumchlorideoplossing, roer grondig en centrifugeer gedurende enkele minuten. Onder de afzuigkap. Breng de onderste organische fase voorzichtig over in schone, vooraf gespoelde, middelgrote buisjes.
Was monsters opnieuw met zoutoplossing, roer en centrifugeer gedurende 10 minuten. Verwijder de bovenste waterige fase, voeg vervolgens anhydrisch natriumsulfaat toe aan monsters als droogmiddel om sporen hoeveelheden water die in de oplossing achterblijven, weg te nemen, roer monsters, centrifugeer en breng het oplosmiddel over in schone, vooraf gespoelde kleine buisjes. Laad buisjes in een stikstofevaporator om het oplosmiddel te verdampen en droge residuen van monomeren te verkrijgen. Voeg met behulp van een glazen spuit 100 microliters purine en 100 microliters B-S-T-F-A toe om hydroxylgroepen om te zetten in vluchtige trimethylcellderivaten.
Incubeer monsters gedurende 10 minuten bij 100 graden. Laat de buisjes afkoelen en verdampen onder stikstofgas. Voeg 500 microliters van een een-op-een HEPTANE-tolueenoplossing toe om de residuen te heroplossen, die vervolgens kort worden gecentrifugeerd.
Breng derivaatmonsters over naar GC-buisjes met 400 microliter inserts. Sluit de buisjes, laad monsters in een gaschromatograaf, die ze in een capillaire
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het depolymeriseren van cutine uit ontvette bladeren, wat essentieel is voor het bestuderen van plantencuticula en suberine biosynthese. De techniek stelt onderzoekers in staat om lipide polyesters en hun monomere samenstelling te analyseren.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Plantkunde
- Biochemie
- Plantenfysiologie
Achtergrond
- Lipide polyesters zijn cruciaal voor modificaties van de plantencelwwand.
- De plantencuticula dient als waterdichte barrière en reguleert transport.
- Cutine is een belangrijk component van de cuticula, samengesteld uit glycerol lipide polyesters.
- Inzicht in de lipidesamenstelling helpt bij het bestuderen van plantenreacties op omgevingsstress.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor het analyseren van lipide polyesters in plantweefsels.
- Om de samenstelling van cutine en zijn rol in de plantenfysiologie te onderzoeken.
- Om onderzoek naar mutanten met veranderde cutine of suberine biosynthese te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Oogsten en homogeniseren van hele bladmonsters.
- Sequentiële oplossingsextracties om oplosbare lipiden te verwijderen.
- Depolymerisatie van lipide polyesters met behulp van natriummethoxide.
- Gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS) voor het analyseren van de monomere samenstelling.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle extractie en analyse van lipide monomeren uit plantweefsels.
- Karakterisering van de monomere samenstelling van bio polyesters.
- Identificatie van verschillen in lipideprofielen tussen wildtype en mutante planten.
- Demonstratie van de betrouwbaarheid van de methode voor toekomstige studies.
Conclusies
- De ontwikkelde methode is effectief voor het bestuderen van lipide polyesters in planten.
- Inzichten die worden verkregen, kunnen de begrip van plantencuticula en suberine functies verbeteren.
- Deze techniek kan worden toegepast op verschillende plantensoorten en mutanten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Compositional analysis of plant cuticle lipid polyesters enables precise interrogation of biosynthetic pathways and functional gene validation in plant systems. This method provides robust, quantitative data essential for target validation and mechanistic de-risking in agricultural biotechnology pipelines. Its scalability and adaptability support portfolio-wide screening of genetic modifications impacting cutin and suberin biosynthesis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional validation of candidate genes involved in cutin and suberin biosynthesis.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying monomeric changes in genetically modified lines.
- Facilitates pathway clarification through comparative analysis of wild type and mutant tissues.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible workflows for isolating and quantifying lipid polyester monomers.
- Generates quantitative outputs suitable for high-throughput screening of plant lines.
- Enables assay development for forward and reverse genetic studies targeting cell wall modifications.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker discovery by linking monomer profiles to phenotypic traits.
- Supports continuity from genetic manipulation to biochemical phenotype validation.
- Informs risk-adjusted advancement of engineered plant lines with altered barrier properties.
Pipeline & Workflow Integration
This analytical workflow bridges early discovery, genetic screening, and translational validation in plant biotechnology R&D.
- Discovery Biology: Quantitative monomer profiling supports hypothesis testing and pathway elucidation.
- Screening: Standardized GC/MS outputs enable reproducible comparison across genotypes and treatments.
- Analytics: Internal standard quantification provides robust, comparable data for cross-sample analysis.
- Translational Research: Monomer composition data inform downstream trait selection and preclinical evaluation.
- Enterprise Reuse: The protocol is adaptable for diverse plant species and tissue types, supporting broad R&D initiatives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in gene function and pathway engineering.
- Operational Value: Delivers scalable, reproducible, and quantitative analytical workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions for advancing engineered plant lines.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of genetic targets and trait development programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant biochemistry and analytical chemistry.
- Demands access to GC/MS instrumentation and validated internal standards.
- Necessitates cross-team standardization for sample preparation and data analysis.
- Adaptable to various plant species and tissue types with protocol optimization.
- Sample throughput and solvent handling safety must be managed for scale-up.
