Isolatie en analyse van de samenstelling van de Plant Nagelriem Lipid Polyester Monomeren

Vasculaire planten zijn afhankelijk van extracellulaire lagen die functioneren als waterdichte barrières tussen planteweefsels en de externe omgeving. Deze lipofiele cel-geassocieerde structuren beperken pathogene infecties en reguleren het passieve transport van gassen, water en opgeloste stoffen in en uit de planteweefsels. Eén belangrijke barrière is de plantencuticula, een complexe structuur die uniek is voor planten.

Cutine is een onoplosbare glycerol-lipidpolyester die de structurele matrix van de cuticula vormt en geassocieerd is met oplosbare wassen. Hier presenteren we een betrouwbare techniek om de samenstelling van lipidpolyesters in plantweefsels te analyseren. In dit protocol worden volledige weefselmonsters geoogst, gehomogeniseerd en volledig behandeld met een reeks oplosmiddelsextracties om oplosbare lipiden te verwijderen, waaronder cuticulaire en epicuticulaire wassen.

Triglycerolen in membraanlipiden. Monsters worden vervolgens gedepolymeriseerd tot hun bestanddelen van lipidemonomeren door middel van natriummethoxide-gekatalyseerde methyrolyse. Derivatiseringsreagentia worden toegevoegd om hydroxylgroepen te transmethyleren tot hun overeenkomstige trimethylcelderivaten, geschikt voor gaschromatografische analyse.

De derivaatresiduen worden vervolgens overgebracht naar GC-vials en geladen in A-G-C-M-S voor analyse, waarbij een chromatogram wordt gegenereerd dat de monomerische samenstelling van biopolyesters karakteriseert. Aanwezig in geëxtraheerde monsters. Hier oogsten we volledige bladmonsters van wild-type en twee mutanten van volwassen arabidopsis ANA-planten.

Voeg voor extractie en analyse 0,5 gram weefsel toe aan schone glazen buisjes die vooraf zijn gespoeld met chloroform. Doe 100 milliliter isopropanol in een kolf en voeg gebutyleerde hydroxytolueen toe tot een concentratie van 0,01%. BHT is een antioxidant die wordt toegevoegd om dubbele bindingen en vetzuren te beschermen tegen oxidatie tijdens solventextracties. Verwarm het solvent voor in een waterbad tot ongeveer 85 graden.

Voeg 25 milliliter verhit isopropanol per gram plantweefsel toe en incubeer de monsters in de hitte-LOC op 85 degrees gedurende 15 minuten. Laat de buizen afkoelen tot kamertemperatuur, terwijl u gehoor- en oogbescherming draagt. Maal de monsters vervolgens met een homogenisator om een homogene dispersie te verkrijgen, sluit de buizen af met schroefdoppen en schud deze op 100 RPM gedurende één tot twee minuten; centrifugeer de monsters vervolgens op 800 G gedurende 10 minuten.

Om de organische fase te scheiden van de materialen met een hogere dichtheid die in het pellet zijn samengeperst, verwijdert u het supernatant met een Pasteurpipet of propent en gooit u dit weg. Zorg ervoor dat het pellet niet wordt verstoord. Voeg een gelijk volume isopropanol op kamertemperatuur toe en schud de monsters gedurende de nacht.

Centrifugeer de monsters bij 100 RPM en verwijder het supernatant. Voeg 25 milliliter van een chloroform-methanoloplossing in een verhouding van twee op één toe per gram weefsel, schud de monsters gedurende de nacht, centrifugeer en verwijder de organische fase. Herhaal dit proces vervolgens met een chloroform-methanoloplossing in een verhouding van één op twee.

Droog de pellet een nacht lang en verplaats de buisjes vanuit de zuurkast naar een vacuümdesiccator met watervrij calciumsulfaat om de monsters gedurende een periode van ten minste drie dagen te dehydrateren, of totdat een constant gewicht is bereikt. Zodra de monsters volledig zijn gedroogd, zijn ze klaar voor defloratie door natriummethoxide-gekatalyseerde metalyse. Voeg met een glazen spuit twee oplossingen van interne standaarden toe aan de buisjes met droog weefsel, beginnend met 25 µL methyl HETO decanoate en 25 µL omega pentec lacton.

Om de diepe polymerisatie te starten, voegt u 0,9 milliliters methylacetaat toe aan de monsters, gevolgd door 1,5 milliliters natriummethoxide-katalysator en 3,6 milliliters methanol. Incubeer de monsters gedurende twee uur bij 60 degrees met periodiek vortexen binnen het reactiesysteem; lipide polyesters reageren met nucleofiele methoxide-anionen om onstabiele tetraëdrische intermediairen te vormen, die gemakkelijk dissociëren in vetzuren, methylesters en oxide-anionen. Deze oxides zijn geconjugeerde basen en reageren met methanol, waarbij de katalytisch actieve methoxide-anionen worden geregenereerd, waardoor verdere diepe polymerisatiereacties worden in stand gehouden.

Als er water in het systeem aanwezig is, zal dit reageren met natriummethoxide om natriumhydroxide te vormen. Dit is een sterke base die polyesters onomkeerbaar omzet in ongewenste vrije vetzuren. Om hydrolyse te voorkomen, wordt methylacetaat toegevoegd om eventueel natriumhydroxide in het systeem te verwijderen.

Laat de buisjes afkoelen tot kamertemperatuur. Extraheer na de incubatie de monomeren door 10 milliliters methyleendichlooride aan elke buis toe te voegen. Voeg vervolgens 1,5 milliliters glaciaal azijnzuur toe om de monsters te verzuren.

Vul de buisjes met 0,5 molaire natriumchlorideoplossing, vortex grondig en centrifugeer gedurende minuten. Voer dit uit onder de zuurkast. Draag de onderste organische fase voorzichtig met een pipet over naar schone, vooraf gespoelde buisjes van middelgroot formaat.

Was de monsters opnieuw met zoutoplossing, vortex en centrifugeer gedurende 10 minuten. Verwijder de bovenste waterige fase en voeg vervolgens watervrij natriumsulfaat toe aan de monsters als droogmiddel om sporen van resterend water in de oplossing te verwijderen; vortex de monsters, centrifugeer en breng het oplosmiddel over naar schone, vooraf gespoelde kleine buisjes. Plaats de buisjes in een stikstofverdamper om het oplosmiddel te verdampen en droge residuen van monomeren te verkrijgen. Voeg met een glasspuit 100 µL purine en 100 µL B-S-T-F-A toe om hydroxylgroepen om te zetten in vluchtige trimethylcelderivaten.

Incubeer de monsters 10 minuten bij 100 °C. Laat de buisjes afkoelen en laat het oplosmiddel verdampen onder nitrogengas. Voeg 500 µL van een heptaan-tolueenoplossing in een verhouding van één-op-één toe om de residuen opnieuw op te lossen, waarna deze kortstondig worden gecentrifugeerd.

Overbreng de derivaatmonsters naar GC-vials met inserts van 400 microliter. Sluit de vials en laad de monsters in een gaschromatograaf, die ze injecteert in een capillaire kolom voor analyse; de eluenten worden vervolgens gedetecteerd door een quadrupool-massaspectrometer. De ruwe gegevens verkregen via GCMS-analyse worden verwerkt en gepresenteerd als een chromatogram voor elk monster.

Individuele monomeren die overeenkomen met verschillende chromatografische pieken worden geïdentificeerd aan de hand van hun specifieke massaspectra. In GC-retentietijden worden de hoeveelheden van individuele monomeren bepaald met behulp van de interne standaardmethode van kwantificering, waardoor vergelijkingen van monomeren abundantie en compositie tussen monsters mogelijk zijn. Hier worden overlay-chromatogrammen getoond van representatieve analyses van monomeren, vrijgemaakt uit bladweefsel van een konijnenabces dat overeenkomt met het wildtype en twee mutante allelen van een gen dat codeert voor een P450-mono-oxygenase enzym, waarbij duidelijk verschillende monomerische profielen zichtbaar zijn.

Onze resultaten tonen significante verschillen aan in de abundantie van drie belangrijke cutine-monomeren in wilde-type en mutante Arabidopsis-planten. Dit protocol is een robuuste methode voor het analyseren van de samenstelling van plantenlipide polyesters door de isolatie, identificatie en kwantificering van hun bestanddelen. De procedure is schaalbaar en kan gemakkelijk worden aangepast om grote hoeveelheden van diverse plantmaterialen te verwerken, waaronder wortels, zaden, bladeren en andere complete weefsels.

Deze techniek is toepasbaar op studies die de biosyntheseregulatie en distributie van cutine en suberine in hogere planten onderzoeken.