Name: Isolatie en analyse van de samenstelling van de Plant Nagelriem Lipid Polyester Monomeren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Leer een betrouwbare methode voor het analyseren van lipidpolyesters in plantenweefsels via depolymerisatie en GC-MS. Deze techniek helpt onderzoekers bij het bestuderen van cutinebiosynthese en plantenfysiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een Natural Sciences and Engineering Research (NSERC)-USRA-subsidie aan S.J., en door een NSERC-Discovery Grant aan I.M. We danken Richard Bourgault, Meghan Rains en Amanda Fluke voor hun technische assistentie. Zaden van att1-1 en att1-2 mutanten werden vriendelijk ter beschikking gesteld door Dr. Jian-Min Zhou, Institute of Genetics and Developmental Biology, Beijing, China.

Opmerking: Dit protocol werd aangepast van Bonaventure et al. (2004), Molina et al. (2006), Li et al. (2013) 7,10,11. Stappen 1-5 zijn in figuur 1. 1. Tissue delipidering Opmerking: Spoel altijd alle glaswerk en petten met chloroform, laten droog onder zuurkast, voor gebruik. LET OP: Voer weefsel homogenisatie en al oplosmiddel overdracht stappen onder zuurkast; draag altijd laboratoriumjas, handschoenen en splash veiligheidsbril om direct contact met chemische stoffen te voorkomen en om de monsters te beschermen tegen besmetting. <ol><li> Verwarm waterbad en warmte blok naar 85 ° C. </li><li> Weeg ongeveer 0,5 g van elk blad monster in pre-gewogen 20 mm x 125 mm glazen reageerbuizen met polytetrafluorethyleen (PTFE) -faced schroefdoppen. Bestaan ​​uit vier herhalingen per monster. </li><li> Plaats 2-propanol in een erlenmeyer (ongeveer 125 ml, 25 ml per g sample). Voeg 2,6-di-tert-butyl-4-methylfenol (ook bekend als gebutyleerd hydroxytolueen, BHT) tot een eindconcentratie van 0,01% (w / v). Opmerking: BHT toevoegen van een 5% (w / v) voorraadoplossing in methanol (BHT minimaliseert oxidatie van onverzadigde vetzuren). </li><li> Verwarm 2-propanol-oplossing tot 85 ° C in een waterbad. </li><li> Voeg 12 ml hete 2-propanol oplosmiddel om elke monsterbuis en verwarm gedurende 15 min bij 85 ° C in warmteblok. Deze stap inactiveert lipasen die kunnen worden vrijgesteld van cellen verstoord. </li><li> Laat buizen afkoelen tot kamertemperatuur en maal weefsel grondig met homogenisator totdat een homogene suspensie wordt verkregen. </li><li> Plaats de monsters in een orbitale schudder en schud gedurende 1-2 uur bij 100 rpm en kamertemperatuur. </li><li> Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 800 x g en verwijder het supernatant. </li><li> Voeg een gelijk volume 2-propanol en schud gedurende 12 uur bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 800 x g en verwijder het supernatant. </li><li> Voeg 12 ml CHCl 3: CH3OH (2: 1, v / v) tot residu (25 ml per g monster) en schudden gedurende de nacht bij 100 rpm en kamertemperatuur. </li><li> Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 800 x g en verwijder het supernatant. </li><li> Voeg 12 ml CHCl3: CH3OH (1: 2, v / v) tot residu schudden overnacht bij 100 rpm en kamertemperatuur. </li><li> Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 800 x g en verwijder het oplosmiddel. </li><li> Laat monsters drogen onder zuurkast overnacht bij kamertemperatuur. </li><li> Lucht-droog het residu en plaats in een vacuümexsiccator boven watervrij CaCl2 of CaSO 4 tot constant gewicht bereikt (3-5 dagen). </li></ol> 2. Depolymerisatie: methanolyse met natriummethoxide (figuur 2) LET OP: Voer de stappen 2,3-2,4, 2,7-2,8, 2,10-2,11, 2,13-2,15 en 2,17-2,18 onder zuurkast; draag altijd laboratoriumjas, handschoenen en een splash veiligheidsbril. <ol><li> Verwarm de hitte blok naar 60 ° C. </li><li> Weeg reageerbuizen met het droge residu (belangrijk voor de verdere berekeningen). </li><li> Voeg interne standaarden aan elke buis: 25 ωL methyl heptadecanoate (1 mg / ml voorraad) en 25 ul ω-pentadecalacton (1 mg / ml voorraad). </li><li> Voeg 0,9 ml methylacetaat, 1,5 ml natriummethoxide en 3,6 ml methanol aan elke buis en cap hen. Als alternatief stelt een reactiemengsel met de drie reagentia en voeg 6-ml aliquots aan elk monster. </li><li> Heat monsters gedurende 2 uur bij 60 ° C en vortex periodiek 15 min intervallen. </li><li> Laat monsters afkoelen tot kamertemperatuur. </li><li> Voeg 10 ml methyleen- dichloride (CH 2 Cl 2) en 1,5 ml ijsazijn aan de vetzuurmethylesters te extraheren. </li><li> Voeg zoutoplossing (0,5 M NaCl) aan elke buis en cap vullen. </li><li> Vortex monsters gedurende 1 minuut en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 800 x g. </li><li> Breng de organische fase (lager) tot middelgrote buizen te reinigen (16 x 125 mm reageerbuizen met polytetrafluorethyleen (PTFE) -faced schroefdop). </li><li> Voeg zoutoplossing (0,5 M NaCl) aan elke buis en cap vullen. </li><li> Vortex monsters gedurende 1 minuut en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 800 x g. </li><li> Verwijder waterige (bovenste) fase en herhaal stappen 2,11-2,12. </li><li> Verwijder alle waterige (bovenste) fase. </li><li> Voeg watervrij natriumsulfaat (Na 2 SO 4) aan het oplosmiddel, cap de buizen en vortex gedurende 1 min; monsters kunnen nu worden gelaten tot de volgende dag. Op dit moment monsters gedurende de nacht onder de afzuigkap worden gelaten. </li><li> Centrifugeer gedurende 2 min bij 800 xg om de Na 2 SO 4 zout in de bodem verdichten. </li><li> Breng de organische fase naar een klein glazen wegwerp buis (13 x 100 mm glazen reageerbuizen met polytetrafluorethyleen (PTFE) -faced schroefdop). </li><li> Damp het oplosmiddel tot droog onder stikstof en verder met de derivatiseringsstap. Indien niet onmiddellijk verwerkt, opslag ingedampt monsters bij -20 ° C (monsters kan eenLSO opgeslagen voordat de verdamping stap). </li></ol> 3. Voorbereiding van derivaten voor gaschromatografie LET OP: Voer stap 3.1.2 en 3.1.5 - 3.1.8 onder een zuurkast; draag altijd laboratoriumjas, handschoenen en een splash veiligheidsbril. <ol><li> Trimethylsilyl derivaten <ol><li> Verwarm de hitte blok tot 100 ° C. </li><li> Voeg 100 gl pyridine en 100 pl BSTFA (N, O-bis-trimethylsilyl trifluoroacetamide) aan elke buis en cap hen. </li><li> Warmte monsters bij 100 ° C gedurende 10 min. </li><li> Laat monsters afkoelen tot kamertemperatuur. </li><li> Damp monsters onder stikstof bij kamertemperatuur. Voorkomen van warmte aan monsters monomeren zijn zeer volatiel in dit stadium. </li><li> Voeg 500 ul van 1: 1 (v / v) heptaan: tolueen. </li><li> Vortex monsters gedurende 1 minuut en centrifugeer gedurende 2 min bij 800 x g. </li><li> Samples toevoegen aan GC flacons en ga naar GC / MS analyse. </li></ol></li><li> Acetylderivaten Opmerking: acetylering, als volgt (niet in video getoond) passen stappen 3.1.1-3.1.3 hierboven; stappen 3.1.4-3.1.8 zijn hetzelfde: <ol><li> Verwarm de hitte blok naar 60 ° C. </li><li> Voeg 100 gl pyridine en 100 pi azijnzuuranhydride (Ac 2 O) aan de buizen. </li><li> Heat monsters 1 uur bij 60 ° C. </li></ol></li></ol> 4. GC / MS-analyse <ol><li> Gebruik een HP-5 capillaire kolom (30 mx 0,25 mm x 0,25 pm laagdikte) of gelijkwaardig (dwz., 5% difenyl, 95% dimethylpolysiloxaan). Programmeer de GC met helium gasstroom ingesteld op 1,5 ml / min en de oventemperatuur geprogrammeerd vanaf 150 tot 300 ° C bij 3 ° C / min. </li><li> Gebruik split injectie (split verhouding 01:10) en stel massaspectrometer de modus scannen via 40-600 amu (electron effect ionisatie). </li><li> Maak een reeks tafel waaronder oplosmiddel (blanco), WT en mutant herhalingen, die elk met behulp van de aangegeven cutine analysemethode. </li><li> Load oplosmiddelen Monsterflesjes op de carrousel, voeg hexaan tot injectiespuit spoelen flacons in de autosampler indien nodig, en start de sequentie. Nadat de sequentie is voltooid, totaal ionenchromatogram sporen voor alle monsters. </li></ol> 5. Data Analysis <ol><li> Identificeren lipide polyester monomeren door elke piek van de massa spectrum aan gepubliceerde massaspectra vergelijken of door te zoeken een commerciële bibliotheek indien beschikbaar. </li><li> Voor elk geïdentificeerd piek in de totale ionenstroom chromatogram, gebruik maken van hun respectieve retentietijden om de gebieden op de integratie van de resultaten tabel van de GC / MS-software (Aanvullende Figuur 1) te vinden. </li><li> Voor elk monomeer (kolommen AB), voeg het gebied waarden gevonden in de integratie tabel (Hulp Figuur 1, kolom D) aan de corresponderende kolom voor elke repliceren monster in de Excel tabel monomeren (Hulp File 2, kolommen CF), die een spreadsheet aan Arabidopsis kwantificerencutine TMSi derivaten. Gebruik Aanvullende File 3 als geacetyleerde derivaten in plaats daarvan worden bereid. </li><li> Voeg de aspecten van de interne standaard (IS) aan de IS kolommen (HK). Voor de monomeren die niet zijn gederivatiseerd, namelijk vetzuurmethylesters (FAME) en dicarbonzuur dimethylesters (DCA DMEs), gebruikt 17: 0 FAME (IS1) als IS voor kwantificering (paars-grijze cellen in het monomeer tabel; Aanvullende bestanden 2/3). Voor gehydroxyleerde monomeren, met inbegrip van primaire alcoholen, ferulinezuur en ω-hydroxy zuren, gebruiken 15: 0 15-hydroxy FAME (IS2) als IS van de keuze voor verbinding kwantificering (groen-shadded cellen in het monomeer tabel; Aanvullende Files 2/3) . </li><li> Voeg droog blad gewicht voor elke repliceren naar kolommen AX-BA (Aanvullende File 2) of AQ-AT (Aanvullende File 3); alternatief, scannen bladeren om oppervlakten te berekenen en toe te voegen gebied waarden aan de monomeer tafel om monomeer ladingen per eenheid uit te drukkenoppervlakte. </li></ol>

<ol><li>Kolattukudy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biopolyester+membranes+of+plants%3A+cutin+and+suberin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Biopolyester membranes of plants: cutin and suberin.</a> Science. 208 (4447), 990-1000 (1980).</li>
<li>Kolattukudy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyesters+in+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Biochem.+Eng.+Biot%22%5BJournal%5D)">Polyesters in higher plants.</a> Adv. Biochem. Eng. Biot. 71, 1-49 (2001).</li>
<li>Yeats, T. H., Rose, J. K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formation+and+function+of+plant+cuticles%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The formation and function of plant cuticles.</a> Plant Physiol. 163 (1), 5-20 (2013).</li>
<li>Pollard, M., Beisson, F., Li, Y., Ohlrogge, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+lipid+barriers%3A+biosynthesis+of+cutin+and+suberin%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Building lipid barriers: biosynthesis of cutin and suberin.</a> Trends Plant Sci. 13 (5), 236-246 (2008).</li>
<li>Beisson, F., Li-Beisson, Y., Pollard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solving+the+puzzles+of+cutin+and+suberin+polymer+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Solving the puzzles of cutin and suberin polymer biosynthesis.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 15 (3), 329-337 (2012).</li>
<li>Heredia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+and+biochemical+characteristics+of+cutin%2C+a+plant+barrier+biopolymer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Biophysical and biochemical characteristics of cutin, a plant barrier biopolymer.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1620 (1-3), 1-7 (2003).</li>
<li>Bonaventure, G., Beisson, F., Ohlrogge, J., Pollard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+aliphatic+monomer+composition+of+polyesters+associated+with+Arabidopsis+epidermis%3A+occurrence+of+octadeca-cis-6%2C+cis-9-diene-1%2C+18-dioate+as+the+major+component%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Analysis of the aliphatic monomer composition of polyesters associated with Arabidopsis epidermis: occurrence of octadeca-cis-6, cis-9-diene-1, 18-dioate as the major component.</a> Plant J. 40 (6), 920-930 (2004).</li>
<li>Franke, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoplastic+polyesters+in+Arabidopsis+surface+tissues+-+A+typical+suberin+and+a+particular+cutin%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Apoplastic polyesters in Arabidopsis surface tissues - A typical suberin and a particular cutin.</a> Phytochemistry. 66 (22), 2643-2658 (2005).</li>
<li>Vogg, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomato+fruit+cuticular+waxes+and+their+effects+on+transpiration+barrier+properties%3A+functional+characterization+of+a+mutant+deficient+in+a+very-long-chain+fatty+acid+-ketoacyl-CoA+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Tomato fruit cuticular waxes and their effects on transpiration barrier properties: functional characterization of a mutant deficient in a very-long-chain fatty acid -ketoacyl-CoA synthase.</a> J. Exp. Bot. 55 (401), 1401-1410 (2004).</li>
<li>Molina, I., Bonaventure, G., Ohlrogge, J., Pollard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lipid+polyester+composition+of+Arabidopsis+thaliana+and+Brassica+napus+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">The lipid polyester composition of Arabidopsis thaliana and Brassica napus seeds.</a> Phytochemistry. 67 (23), 2597-2610 (2006).</li>
<li>Li-Beisson, Y., et al. Acyl-lipid metabolism. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLi-Beisson%2C+Y+%22The+Arabidopsis+Book%22">The Arabidopsis Book</a>. 11, e0161(2013).</li>
<li>Christie, W. W. Mass Spectrometry of Fatty Acid Derivatives. , LipidHome. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.lipidhome.co.uk/ms/masspec.html">http://www.lipidhome.co.uk/ms/masspec.html</a> (2015).</li>
<li>Molina, I., Ohlrogge, J. B., Pollard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deposition+and+localization+of+lipid+polyester+in+developing+seeds+of+Brassica+napus+and+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Deposition and localization of lipid polyester in developing seeds of Brassica napus and Arabidopsis thaliana.</a> Plant J. 53 (3), 437-449 (2008).</li>
<li>Xiao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+CYP86A2+represses+Pseudomonas+syringae+type+III+genes+and+is+required+for+cuticle+development%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis CYP86A2 represses Pseudomonas syringae type III genes and is required for cuticle development.</a> EMBO J. 23 (14), 2903-2913 (2004).</li>
<li>Christie, W. W., Han, X. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChristie%2C+WW+%22Lipid+Analysis+-+Isolation%2C+Separation%2C+Identification+and+Lipidomic+Analysis%22">Lipid Analysis - Isolation, Separation, Identification and Lipidomic Analysis</a>. , 4th edition, Oily Press. Bridgwater, U.K. 446(2010).</li>
<li>Walton, T. J., Kolattukudy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+structures+of+cutin+monomers+by+a+novel+depolymerization+procedure+and+combined+gas+chromatography+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Determination of the structures of cutin monomers by a novel depolymerization procedure and combined gas chromatography and mass spectrometry.</a> Biochemistry. 11 (10), 1885-1896 (1972).</li>
<li>Matzke, K., Riederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+into+the+chemical+constitution+of+cutins+and+suberins+from+Picea+abies+%28L.%29+Karst.%2C+Quercus+robur+L.%2C+and+Fagus+sylvatica+L%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">A comparative study into the chemical constitution of cutins and suberins from Picea abies (L.) Karst., Quercus robur L., and Fagus sylvatica L.</a> Planta. 185 (2), 233-245 (1991).</li>
<li>Riederer, M., Schönherr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+gas+chromatographic+analysis+of+methyl+esters+of+hydroxy+fatty+acids+derived+from+plant+cutin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Quantitative gas chromatographic analysis of methyl esters of hydroxy fatty acids derived from plant cutin.</a> J. Chromatogr. 360, 151-161 (1986).</li>
<li>Moire, L., Schmutz, A., Buchala, A., Yan, B., Stark, R., Ryser, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycerol+Is+a+Suberin+Monomer.+New+Experimental+Evidence+for+an+Old+Hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Glycerol Is a Suberin Monomer. New Experimental Evidence for an Old Hypothesis.</a> Plant Physiol. 119 (3), 1137-1146 (1999).</li>
<li>Graça, J., Schreiber, L., Rodrigues, J., Pereira, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycerol+and+glyceryl+esters+of+omega-hydroxyacids+in+cutins%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Glycerol and glyceryl esters of omega-hydroxyacids in cutins.</a> Phytochemistry. 61 (2), 205-215 (2002).</li>
<li>Eglinton, G., Hunneman, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas+chromatographic-mass+spectrometric+studies+of+long+chain+hydroxy+acids-I%3A+The+constituent+cutin+acids+of+apple+cuticle%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Gas chromatographic-mass spectrometric studies of long chain hydroxy acids-I: The constituent cutin acids of apple cuticle.</a> Phytochemistry. 7 (2), 313-322 (1968).</li>
<li>Espelie, K. E., Köller, W., Kolattukudy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((9%2C16-dihydroxy-10-oxo-hexadecanoic+acid%2C+a+novel+component+in+citrus+cutin%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Lipids%22%5BJournal%5D)">9,16-dihydroxy-10-oxo-hexadecanoic acid, a novel component in citrus cutin.</a> Chem. Phys. Lipids. 32 (1), 13-26 (1983).</li>
<li>Holloway, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracuticular+lipids+of+spinach+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Intracuticular lipids of spinach leaves.</a> Phytochemistry. 13 (10), 2201-2207 (1974).</li>
<li>Holloway, P. J., Deas, A. H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epoxyoctadecanoic+acids+in+plant+cutins+and+suberins%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Epoxyoctadecanoic acids in plant cutins and suberins.</a> Phytochemistry. 12 (7), 1721-1735 (1973).</li>
<li>Holloway, P. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHolloway%2C+PJ+%22The+chemical+constitution+of+plant+cutins%22">The chemical constitution of plant cutins</a>. Cutler, D. F., Alvin, K. L., Price, C. E. , Academic Press. London. 45-85 (1982).</li>
<li>Croteau, R., Fagerson, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+constituent+cutin+acids+of+cranberry+cuticle%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">The constituent cutin acids of cranberry cuticle.</a> Phytochemistry. 11 (1), 353-363 (1972).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

In tegenstelling tot andere biopolymeren zoals DNA en proteïnen, worden plantaardige lipiden polyesters niet via een template. In plaats daarvan, de samenstellingen afhankelijk van de specificiteit van de in de weefsels die deze extracellulaire polymeren maken enzymen. Als zodanig, chemische analyses van de samenstellende componenten essentieel lipide polyestersamenstelling begrijpen. Chemische werkwijzen voor splitsen esterbindingen bevatten verzepen, hydrogenolyse, zuur-gekatalyseerde transmethylering en base-gekatalyseerde transmethylering 2. Elk van hen heeft voordelen en nadelen. Verzeping produceert vrije vetzuren hydroxy zuren die secundaire reacties kunnen ondergaan. Hydrogenolyse met lithiumaluminiumhydride (LiAlH4) 16 werd gebruikt voor analyse cutine 7. Hydrogenolyse vermindert gefunctionaliseerde koolstoffen alcoholen en de oorspronkelijke structuren moeten worden afgeleid door deuteriolysis met lithium aluminium deuteride (LiAlD 4). Denadeel van deze benadering is dat hoge resolutie GC / MS om de mate van deuteriation van de vetzuren polyolen verkregen opdrachten hun structuren te vergelijken. Zuur gekatalyseerde omestering met methanol boortrifluoride (BF3) is veelvuldig bij cutin en suberine depolymerizations 8,17,18, maar het reagens beperkt houdbaar en kunnen artefacten vanwege reacties 15 kant voeren. Methanol zwavelzuur levert ook methylesters van de monomeren, maar met grotere hoeveelheden van 2-hydroxy vetzuren, die vermoedelijk geen echte lipide polyester componenten, in vergelijking met andere methoden 10. De NaOMe-gekatalyseerde omestering werkwijze beschreven in dit protocol produceert vetzuurmethylesters die zijn gederivatiseerd door silylering van hydroxylgroepen, die kenmerkend massaspectra voor identificatie of door acetylering meer stabiele derivaten van hydroxylgroepen verschaffen for kwantificering. Een nadeel van deze techniek is dat hydrolyse concurreert met transesterificatie wanneer water aanwezig in de reactie. Water reageert met NaOMe (de katalysator) en produceert NaOH, die op zijn beurt hydrolyseert vetzuurmethylesters aan vrije vetzuren (figuur 2D) werd verkregen. Dit is een ongewenste nevenreactie omdat twee pieken voor elk vetzuur aanwezig zijn: methyl ester en een TMSi esterderivaat, waardoor de analyse bemoeilijkt. Met behulp van watervrije reagentia en het toevoegen methylacetaat als een co-oplosmiddel om te concurreren met verzeping dus cruciaal stappen hydrolyse (figuur 2D) te voorkomen. Cutine en suberine bevatten tussen 1 en 26% glycerol 4. Dit zal echter monomeer niet worden gedetecteerd door de in dit protocol beschreven experimentele omstandigheden. Glycerol is sterk hydrofiel en, anders dan vetzure methylester monomeren wordt in het waterige oplosmiddel stappen wassen worden verwijderd. Deze beperking ookpplies andere cutin depolymerisatie werkwijzen, maar glycerol kan worden bepaald in de waterige laag verkregen na omestering onder toepassing van een enzymatische methode. Alternatief kan gekwantificeerd worden met mildere omstandigheden (bijv., 0,05 M NaOMe) zonder verdere extractie met water om alle sporen monomeren, zoals glycerol 19,20 .Hoewel bruikbaar voor het doel van glycerol kwantificering milde omstandigheden geven meestal onvolledige depolymerisatie van cutin en suberine. Als een GC gekoppeld met een vlamionisatiedetector (FID) beschikbaar is, kunnen alle replicaten worden geanalyseerd instrument voor kwantitatieve doeleinden, na toppen van een representatief monster zijn geïdentificeerd met GC / MS. Als alternatief kunnen monomeren in het GC / FID sporen worden geïdentificeerd als hun retentie indices zijn bekend. De vlamionisatiedetector heeft bijzonder hoge gevoeligheid en een breed scala van evenredigheid wat essentieel voor het kwantificeren van grote en kleine monsterbestanddelenin enkele runs. Bovendien is robuust en gemakkelijk te onderhouden en te bedienen 15. De beschreven protocol zorgt voor een betrouwbare en reproduceerbare isolatie, identificatie en kwantificatie van plantaardige lipiden polyester monomeren, waardoor de chemische karakterisering van mutanten die verschillen in de samenstelling van één of meer lipide polyester monomeren. De procedure is schaalbaar, kan gemakkelijk worden aangepast voor zowel kleine als grote hoeveelheden van verschillende plantaardige materialen, zoals wortels, zaden, bladeren, stengels en bloemen verwerken. Massaspectrumgegevens van lipide polyester monomeren van vele soorten zijn bijvoorbeeld gepubliceerd., 21-26 en vormen waardevolle middelen om onbekende monomeren te identificeren bij de aanpassing van dit protocol om andere weefsels en / of soorten. Deze methode is van toepassing op het onderzoek van de biosynthese, regelgeving, en de verdeling van lipiden polyesters in hogere planten.

Vaatplanten afhankelijk extracellulaire lagen die als waterdichte barrières tussen plantenweefsels en de externe omgeving. Deze lipofiele celwand geassocieerde structuren beperken pathogene infectie en regelen het passieve transport van gassen, water en opgeloste stoffen in en uit plantenweefsels 1. Dergelijke barrières zijn de plant cuticula, een synapomorphic structuur unieke planten 2, en anders-suberine bevatten diffusiebarrières. De cuticula is een oleofiele laag gesynthetiseerd door epidermale cellen en bonden ze via een pectinaceous laag op de extracellulaire zijde van de celwand 3-5. Het omhult de primaire antenne organen van hogere planten, functioneren als een essentiële interface tussen plantenweefsels en milieu. Cutine, de structurele matrix van de cuticula en suberine zijn twee onoplosbaar glycerolipide polyesters geassocieerd met oplosmiddel-uittrekbare wassen 2,4. Deze polymere lipids bestaan ​​uit verzadigde en onverzadigde vetzuurderivaten en zowel structureel en functioneel vergelijkbaar. Ze zijn echter onderscheiden door karakteristieke verschillen in chemische samenstelling en depositie sites. Suberine een alifatische polyester zich in de celwanden van bepaalde externe en interne weefsels vormen van een secundaire wand. Suberized weefsels onder periderms van wortels, knollen en boomschors, wortel endodermis, zaadhuid lagen, en genezen wonden 2. Anders cutine, de suberin polyester bevat typisch alcoholen, verzadigde en mono-onverzadigde dicarbonzuren, en een groot deel van zeer lange keten monomeren (C≥20). Cutin is het meest voorkomende lipide polyester vaatplanten 6 en bestaat uit glycerol en C16-C18 vetzuur veresterde derivaten, zoals hydroxy en hydroxy-gesubstitueerde epoxy-vetzuren 4. Hoewel de samenstelling van polymeren cutinvarieert in tracheophyte species, de meest overheersende primaire monomeren 10, 16-dihydroxy-16: 0, 18-hydroxy-9,10-epoxy 18: 0 en 9,10,18-tri- 18: 0-vetzuren. Interessant Arabidopsis blad en stengel cutin bestaat hoofdzakelijk uit 18: 2 dicarbonzuur 7,8. Plant opperhuid vormen ook een aanzienlijke variabiliteit in dikte variërend van enkele nanometers tot enkele micrometers 9. Aangezien cuticula isolatie is een moeizame en tijdrovende stap, met name voor zeer dunne leaf cuticles zoals die van Arabidopsis thaliana 8 zijn werkwijzen die cuticula isolatie omzeilen ontwikkeld en gevalideerd 7,8. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de monomeersamenstelling van cutin in Arabidopsis thaliana bladeren van natriummethoxide (NaOMe) gekatalyseerde depolymerisatie en daaropvolgende gaschromatografie / massaspectrometrie (GC / MS) analyse bestuderen. Dit protocol biedt een robuuste methode voor het bepalen van de composition van plantaardige lipiden polyesters geheel ontvette weefsels, en is aangepast van eerder gerapporteerde protocollen 7,10,11. Hele weefselmonsters zijn eerste gehomogeniseerd en uitputtend gedelipideerd, het verwijderen van solvent-extraheerbare lipiden waaronder cuticulair en epicuticular wassen, membraanlipiden, en triacylglycerolen. Celwand verrijkte resten worden vervolgens gedepolymeriseerd in hun samenstellende methylester monomeren van natrium methoxide-gekatalyseerde methanolyse. Fatty acid methyl esters worden geëxtraheerd na aanzuren, en gederivatiseerd hun overeenkomstige trimethylsilyl of acetyl derivaten te verkrijgen. Gederivatiseerde residuen zijn zeer volatiel en kan worden geëlueerd van een gaschromatografiekolom bij een redelijke temperatuur zonder dat de structurele conformatie in GC / MS-analyse.

<table><tbody><tr><td>Chemicaliën</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BPA451-4</td><td>Solvent voor delipidatie</td></tr><tr><td>Watervrij natriumsulfaat</td><td>Fisher Scientific</td><td>S421500</td><td></td></tr><tr><td>Azetzuuranhydride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320102</td><td>Derivatiseringsmiddel</td></tr><tr><td>BSTFA (N,O-bis(trimethylsilyl)-trifluoraceetamide)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15222</td><td>Derivatiseringsmiddel</td></tr><tr><td>Butylhydroxytolueen (BHT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>101162</td><td>Antioxidant</td></tr><tr><td>Calciumchloride, watervrij</td><td>Fisher Scientific</td><td>C614-3</td><td>Droogmiddel</td></tr><tr><td>Calciumsulfaat, watervrij (DRIERITE- 8 MESH met indicator)</td><td>Acros Organics</td><td>219090020</td><td>Droogmiddel</td></tr><tr><td>Chloroform (Trichloromethaan)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C6074</td><td>Organisch oplosmiddel</td></tr><tr><td>IJsazijn</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2401212</td><td>Acidificatiemiddel</td></tr><tr><td>Helium dragergas, gecomprimeerd</td><td>Air Liquide</td><td>ALPHAGAZ1-UN1046</td><td>Dragergas, GC/MS</td></tr><tr><td>Heptaan</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3501</td><td>Organisch oplosmiddel</td></tr><tr><td>Hexaan</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3024</td><td>Organisch oplosmiddel</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4124</td><td>Organisch oplosmiddel, transmethylering reactief</td></tr><tr><td>Methylacetaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296996</td><td>Organisch oplosmiddel</td></tr><tr><td>Methylheptadecanoaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4515</td><td>Interne standaard (1mg/mL stock)</td></tr><tr><td>Methyleen dichloride (Dichloromethaan)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D374</td><td>Organisch oplosmiddel</td></tr><tr><td>Stikstof, gecomprimeerd</td><td>Air Liquide</td><td>ALPHAGAZ1-UN1044</td><td>Dragergas, GC-FID</td></tr><tr><td>Pentadecanolacton</td><td>Fluka</td><td>76530</td><td>Interne standaard (1 mg/ml stock)</td></tr><tr><td>Pyridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270970</td><td>Co-oplosmiddel voor derivatisering</td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358212</td><td>Zoutoplossing</td></tr><tr><td>Natriummethoxide (25 wt.%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>156256</td><td>Nucleofiel</td></tr><tr><td>Tolueen</td><td>FIsher Scientific</td><td>T2904</td><td>Organisch oplosmiddel</td></tr><tr><td>Plantengroei benodigdheden</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pro-Mix PGX</td><td>Premier Tech Horticulture Ltd</td><td></td><td>Pro-Mix PGX wordt aanbevolen om Arabidopsis planten te kweken (Eddy, R. en Hahn, D.T., 2012,http://docs.lib.purdue.edu/pmag/2) Purdue-methoden voor Arabidopsis-groei.&nbsp;</td></tr><tr><td>PermaNest Humidity Dome&nbsp;</td><td>Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN&nbsp;</td><td>GD2211-24</td><td></td></tr><tr><td>Perma-Nest Plant Trays (22x11in)</td><td>Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Vierkante kas potten, 3,5 inch&nbsp;</td><td>Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN&nbsp;</td><td>P86</td><td></td></tr><tr><td>Algemeen doel plantenmest, Plant-Prod 20-20-20</td><td>Premier Tech Home and Garden In., Brantford, ON</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Glebaarderij</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>13 x 100 mm glazen testbuis met Teflon-gecoate schroefdop</td><td>Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td><td>45066A-13100</td><td></td></tr><tr><td>16 x 125 mm glazen testbuis met Teflon-gecoate schroefdop</td><td>Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td><td>45066A-16125</td><td></td></tr><tr><td>20 x 125 mm glazen testbuizen met Teflon-gecoate schroefdop</td><td>Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td><td>45066A-20125</td><td></td></tr><tr><td>GC-vial caps</td><td>National Scientific</td><td>C400051A</td><td></td></tr><tr><td>GC-vial micro-inserts</td><td>National Scientific</td><td>C4011631</td><td></td></tr><tr><td>GC-vials</td><td>National Scientific</td><td>C40001</td><td></td></tr><tr><td>Wegwerp pasteur pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367820B</td><td></td></tr><tr><td>Kolven</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Allegra X15R centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analytische balans</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Belly dancer</td><td></td><td></td><td>Een shaker kan voor dit doel worden gebruikt als Belly Dancer niet beschikbaar is</td></tr><tr><td>DB-5 capillaire GC-kolom</td><td>J&amp;W Scientific, CA, USA;&nbsp;</td><td></td><td>30 m x 0,25 mm x 0,25 &mu;m filmdikte</td></tr><tr><td>Desiccator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 202 waterbad</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ISQ LT enkele quadupole massaspectrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hitteblok</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stikstofevaporator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polytron homogenisator</td><td>Birkmann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trace 1300 gaschromatograaf</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Twee-traps regelaar</td><td>Air Liquide</td><td>Q1-318B-580</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum desiccator</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortexmixer</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie en analyse van de samenstelling van de plant nagelriem lipid polyester monomeren

Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

Terrestrische planten produceren extracellulaire alifatische biopolyesters die de celwanden van specifieke weefsels wijzigen. Epidermale cellen synthetiseren cutine, een polyester van glycerol en gemodificeerde vetzuren die het raamwerk vormt van de cuticula die luchtplantoppervlakken bedekt. Suberine is een verwante lipide-polyester die wordt afgezet op de celwanden van bepaalde weefsels, inclusief de wortelendodermis en de periderm van knollen, boomschors en wortels. Deze lipidepolymeren zijn zeer variabel in samenstelling tussen plantensoorten en verschillen vaak tussen weefsels binnen een enkele soort. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol om de monomeersamenstelling van cutine in Arabidopsis thaliana bladeren te bestuderen door middel van natriummethoxide (NaOMe)-gekatalyseerde depolymerisatie, derivatisering en daaropvolgende gaschromatografie-massaspectrometrie (GC/MS) analyse. Deze methode kan worden gebruikt om de monomeren van onoplosbare polyesters te onderzoeken die zijn geïsoleerd uit volledig ontvette plantweefsels met cutine of suberine. De methode kan niet alleen worden toegepast om de samenstelling van lipidepolymeren te karakteriseren in soorten die niet eerder zijn geanalyseerd, maar ook als analytisch hulpmiddel in voorwaartse en omgekeerde genetische benaderingen om de functie van kandidaatgenen te beoordelen.

De in dit manuscript beschreven protocol is ingesteld op lipide polyester monomeren bepalen, het minimaliseren van de bijdrage van niet-cutin lipiden 10 Figuur 1 geeft een overzicht van de assay, die in totaal duurt 8 (dwz cutin of suberin.) -. 10 dagen (van initiële weefsel oogsten te verkrijgen GC gegevens), afhankelijk van hoe lang monsters drogen. De geselecteerde base gekatalyseerde methanolyse (figuur 2) gebruikt om polyesters te depolymeriseren is eerder gevalideerd voor Arabidopsis zaden, die zowel cutin en suberine bevatten. Weefsels worden eerst gehomogeniseerd en uitputtend gedelipideerd om oplosmiddel-extraheerbare lipiden te verwijderen. Het residu opbrengst na extractie, als percentage van het oorspronkelijke vers gewicht, is meestal 6% voor A. thaliana Col-0 bladeren. Celwand verrijkte residu gedroogd in een vacuümexsiccator en vervolgens gedepolymeriseerd in hun samenstellende methylester monomeren doorbase-gekatalyseerde transmethyleringsmetabolisme. Twee uur incubatie werd gekozen als de kritische tijd vereist voor correcte depolymerisatie en terugwinning van lipide componenten polyester. Langere incubatietijden resulteerde in toename van 2-hydroxyzuren; deze potentieel afkomstig van vlies sfingolipiden 10. Een chromatogram als wildtype Arabidopsis leaf cutin wordt getoond in figuur 3, voor O -TMSi etherderivaten (figuur 3A) en O-acetyl derivaten (figuur 3B). Elke piek werd geïdentificeerd door vergelijking met massaspectra uit de literatuur 7,8 en een openbare database 12 .Onze video protocol laat zien hoe TMSi derivaten te bereiden, maar monsters kunnen ook worden geacetyleerd om hydroxylgroepen derivatiseren. Gesilyleerde derivaten zijn goed voor identificatiedoeleinden omdat ze diagnostische massaspectra. Echter, geacetyleerde derivaten stabieler en een goed alternatief voor silyleringmonomeren eenmaal zijn geïdentificeerd 10. Om de uitvoering van dit protocol in laboratoria die alleen hebben GC gekoppeld aan vlamionisatiedetector (FID), GC / FID sporen die overeenkomt met geacetyleerde derivaten van WT blad cutin monomeren en een homoloog reeks vetzuurmethylester normen worden ook getoond (Aanvullende figuur 4). Deze methode is de kwalitatieve en kwantitatieve verschillen tussen de monsters, vandaar de waarde mutant analyse detecteert. De bedragen van de individuele monomeren worden bepaald met behulp van de interne standaard methode van kwantificering, waardoor vergelijkingen van monomeer overvloed tussen de monsters. Het moet duidelijk echter dat de piekgrootte (totaal ion tellingen) niet kunnen weerspiegelen molverhoudingen van de monomeren in het polyester. We zijn inclusief bewerkbare tabellen van monomeren monomeer bedragen in Arabidopsis blad cutine berekenen vetzuurmethylesters en TMSi derivaten (Aanvullende File 1), of aas<html> Tyl derivaten (Aanvullende File 2) van alcoholen. Deze tabellen kunnen moeten worden aangepast wanneer monsters worden geëxtraheerd uit verschillende organen of plantensoorten. Als voorbeeld hebben we onderzocht Arabidopsis thalia na Columbia (Col-0) wildtype bladeren en twee eerder gekarakteriseerde null-mutant allelen van de CYP86A2 / ATT1 gen att1-1 (m-1) en att1-2 (m-2 ) 13,14. Cytochroom P450 monooxygenases van de CYP86A onderfamilie coderen vermeende ω-oxydases en neem deel aan suberine en cutin monomeer biosynthese. Onze resultaten (Figuur 4) tonen een significante reductie van de ladingen van drie grote lipide monomeren in de mutant bladeren in vergelijking met WT bladeren. In overeenstemming met voorspelde functie van enzymen, 16: 0, 18: 2 en 18: 1 dicarboxylaten werden specifiek aangetast ATT1 mutanten. &quot;Src =&quot; / files / ftp_upload / 53.386 / 53386fig1.jpg &quot;/&gt; Figuur 1. Overzicht van lipide polyester analyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig2.jpg" /> Figuur 2. Mechanisme van de NaOMe-gekatalyseerde transmethylering reactie. De nucleofiele anionen methoxide vallen de cabonyl koolstof van lipide polyesters een onstabiel tetraëdrische tussenproduct (A), dat gemakkelijk uiteenvalt in vetzuurmethylesters en anionen alkoxide (B) te vormen. Deze alkoxiden zijn conjugaat bases, en reageren met methanol, het regenereren van de katalytisch actieve methoxide anionen, waardoor extra depolymerisatie reacties (C) het behoud. Als water aanwezig is in hetsysteem, zal het reageren met natriummethoxide tot natriumhydroxide, een sterke base die onomkeerbaar gehydrolyseerd esters ongewenste vrije vetzuren te produceren te vormen. Methylacetaat wordt toegevoegd als een co-oplosmiddel 15 tot kleine hoeveelheden natriumhydroxide binnen het systeem (D) te verwijderen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig3.jpg" /> Figuur 3. Vertegenwoordiger totaal ionenchromatogram van wild-type Arabidopsis thaliana blad cutine monomeren. (A) O trimethylsilyl (TMSi) ether en (B) acetaat hydroxyl-derivaten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> </a&gt; <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig4.jpg" /> Figuur 4. Cutin monomeersamenstelling van Arabidopsis thaliana WT en twee nul mutant allelen van de CYP86A2-gen. (Mutant-1 = att1-1, mutant-2 = att1-2) Foutbalken geven de standaarddeviatie van het gemiddelde (n = 4) . Aangepast van 13, met toestemming van © Blackwell Publishing (2007). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig1.jpg" /> Aanvullende Figuur 1. Peak integratie resultaten tabel van de GC / MS-software. Pieken die overeenkomen met die monomeren en interne standaarden worden geïdentificeerd door hun retenti<html> op tijd (kolom C) en het gebied waarden zijn in tabelvorm in kolom D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_Figure_1.tif" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig2.jpg" /> Aanvullende File 2. Tabel van Arabidopsis cutine monomeren (trimethylsilyletherderivaten van hydroxy vetzuurmethylesters). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_File_2_Cutin_template_TMSi.xls" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a> <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig3.jpg" /> Aanvullende File 3. Tabel van Arabidopsis cutine monomeren (O-acetyl derivaten van hydroxy vetzuurmethylesters).com / files / ftp_upload / 53.386 / Supplemental_File_3_Cutin_template_Acetylated_derivatives.xlsx &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om dit bestand te downloaden. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig4.jpg" /> Aanvullende Figuur 4. GC / FID sporen (AB) vetzure methylester (FAME) retentie-index standaarden (pieken worden aangeduid met elkaar verzadigde FAME ketenlengte); en (C) geacetyleerd A. WT blad thaliana cutine monomeren. Aantallen op peak toegekend: 16: 0 FAME (1), ferulate (2), 18: 3 FAME (3), 18: 18/01: 2 FAME (4), 18: 0 FAME (5), sinapate (6 ) 16: 0 DCA (7), 16-OH 16: 0 FAME (8), 18: 2 DCA (9), 18: 1 DCA (10) 18: 0 DCA (11), 18-OH 18: 2 FAME (12), 18-OH 18: 1 FAME (13), 20: 0 FAME (14), 10,16-DIOH 16: 0 FAME (15), 24: 0 FAME (16). DCA: dicarbonzuurdimethylester; FAME: fatty acid methyl ester; IS1: interne standaard 1, 17: 0 FAME; IS2: interne stAndard 2, 15-OH 15: 0 FAME. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_Figure_4.tif" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Lipide polyesters vormen de structurele componenten van twee celwandmodificaties, de plantencuticula en suberine-bevattende diffusiebarriers. In deze video beschrijven we een methode om cutine te depolymeriseren uit volledig ontvette bladeren. De methode kan worden toegepast op het onderzoeken van mutanten die beperkt zijn in de biosynthese van cutine of suberine.

Isolatie en analyse van de samenstelling van de Plant Nagelriem Lipid Polyester Monomeren

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester ...

Vasculaire planten zijn afhankelijk van extracellulaire lagen die functioneren als waterdichte barrières tussen planteweefsels en de externe omgeving. Deze lipofiele cel-geassocieerde structuren beperken pathogene infecties en reguleren het passieve transport van gassen, water en opgeloste stoffen in en uit de planteweefsels. Eén belangrijke barrière is de plantencuticula, een complexe structuur die uniek is voor planten.Cutine is een onoplosbare glycerol-lipidpolyester die de structurele matrix van de cuticula vormt en geassocieerd is met oplosbare wassen. Hier presenteren we een betrouwbare techniek om de samenstelling van lipidpolyesters in plantweefsels te analyseren. In dit protocol worden volledige weefselmonsters geoogst, gehomogeniseerd en volledig behandeld met een reeks oplosmiddelsextracties om oplosbare lipiden te verwijderen, waaronder cuticulaire en epicuticulaire wassen.Triglycerolen in membraanlipiden. Monsters worden vervolgens gedepolymeriseerd tot hun bestanddelen van lipidemonomeren door middel van natriummethoxide-gekatalyseerde methyrolyse. Derivatiseringsreagentia worden toegevoegd om hydroxylgroepen te transmethyleren tot hun overeenkomstige trimethylcelderivaten, geschikt voor gaschromatografische analyse.De derivaatresiduen worden vervolgens overgebracht naar GC-vials en geladen in A-G-C-M-S voor analyse, waarbij een chromatogram wordt gegenereerd dat de monomerische samenstelling van biopolyesters karakteriseert. Aanwezig in geëxtraheerde monsters. Hier oogsten we volledige bladmonsters van wild-type en twee mutanten van volwassen arabidopsis ANA-planten.Voeg voor extractie en analyse 0,5 gram weefsel toe aan schone glazen buisjes die vooraf zijn gespoeld met chloroform. Doe 100 milliliter isopropanol in een kolf en voeg gebutyleerde hydroxytolueen toe tot een concentratie van 0,01%. BHT is een antioxidant die wordt toegevoegd om dubbele bindingen en vetzuren te beschermen tegen oxidatie tijdens solventextracties. Verwarm het solvent voor in een waterbad tot ongeveer 85 graden.Voeg 25 milliliter verhit isopropanol per gram plantweefsel toe en incubeer de monsters in de hitte-LOC op 85 degrees gedurende 15 minuten. Laat de buizen afkoelen tot kamertemperatuur, terwijl u gehoor- en oogbescherming draagt. Maal de monsters vervolgens met een homogenisator om een homogene dispersie te verkrijgen, sluit de buizen af met schroefdoppen en schud deze op 100 RPM gedurende één tot twee minuten; centrifugeer de monsters vervolgens op 800 G gedurende 10 minuten.Om de organische fase te scheiden van de materialen met een hogere dichtheid die in het pellet zijn samengeperst, verwijdert u het supernatant met een Pasteurpipet of propent en gooit u dit weg. Zorg ervoor dat het pellet niet wordt verstoord. Voeg een gelijk volume isopropanol op kamertemperatuur toe en schud de monsters gedurende de nacht.Centrifugeer de monsters bij 100 RPM en verwijder het supernatant. Voeg 25 milliliter van een chloroform-methanoloplossing in een verhouding van twee op één toe per gram weefsel, schud de monsters gedurende de nacht, centrifugeer en verwijder de organische fase. Herhaal dit proces vervolgens met een chloroform-methanoloplossing in een verhouding van één op twee.Droog de pellet een nacht lang en verplaats de buisjes vanuit de zuurkast naar een vacuümdesiccator met watervrij calciumsulfaat om de monsters gedurende een periode van ten minste drie dagen te dehydrateren, of totdat een constant gewicht is bereikt. Zodra de monsters volledig zijn gedroogd, zijn ze klaar voor defloratie door natriummethoxide-gekatalyseerde metalyse. Voeg met een glazen spuit twee oplossingen van interne standaarden toe aan de buisjes met droog weefsel, beginnend met 25 µL methyl HETO decanoate en 25 µL omega pentec lacton.Om de diepe polymerisatie te starten, voegt u 0,9 milliliters methylacetaat toe aan de monsters, gevolgd door 1,5 milliliters natriummethoxide-katalysator en 3,6 milliliters methanol. Incubeer de monsters gedurende twee uur bij 60 degrees met periodiek vortexen binnen het reactiesysteem; lipide polyesters reageren met nucleofiele methoxide-anionen om onstabiele tetraëdrische intermediairen te vormen, die gemakkelijk dissociëren in vetzuren, methylesters en oxide-anionen. Deze oxides zijn geconjugeerde basen en reageren met methanol, waarbij de katalytisch actieve methoxide-anionen worden geregenereerd, waardoor verdere diepe polymerisatiereacties worden in stand gehouden.Als er water in het systeem aanwezig is, zal dit reageren met natriummethoxide om natriumhydroxide te vormen. Dit is een sterke base die polyesters onomkeerbaar omzet in ongewenste vrije vetzuren. Om hydrolyse te voorkomen, wordt methylacetaat toegevoegd om eventueel natriumhydroxide in het systeem te verwijderen.Laat de buisjes afkoelen tot kamertemperatuur. Extraheer na de incubatie de monomeren door 10 milliliters methyleendichlooride aan elke buis toe te voegen. Voeg vervolgens 1,5 milliliters glaciaal azijnzuur toe om de monsters te verzuren.Vul de buisjes met 0,5 molaire natriumchlorideoplossing, vortex grondig en centrifugeer gedurende minuten. Voer dit uit onder de zuurkast. Draag de onderste organische fase voorzichtig met een pipet over naar schone, vooraf gespoelde buisjes van middelgroot formaat.Was de monsters opnieuw met zoutoplossing, vortex en centrifugeer gedurende 10 minuten. Verwijder de bovenste waterige fase en voeg vervolgens watervrij natriumsulfaat toe aan de monsters als droogmiddel om sporen van resterend water in de oplossing te verwijderen; vortex de monsters, centrifugeer en breng het oplosmiddel over naar schone, vooraf gespoelde kleine buisjes. Plaats de buisjes in een stikstofverdamper om het oplosmiddel te verdampen en droge residuen van monomeren te verkrijgen. Voeg met een glasspuit 100 µL purine en 100 µL B-S-T-F-A toe om hydroxylgroepen om te zetten in vluchtige trimethylcelderivaten.Incubeer de monsters 10 minuten bij 100 °C. Laat de buisjes afkoelen en laat het oplosmiddel verdampen onder nitrogengas. Voeg 500 µL van een heptaan-tolueenoplossing in een verhouding van één-op-één toe om de residuen opnieuw op te lossen, waarna deze kortstondig worden gecentrifugeerd.Overbreng de derivaatmonsters naar GC-vials met inserts van 400 microliter. Sluit de vials en laad de monsters in een gaschromatograaf, die ze injecteert in een capillaire kolom voor analyse; de eluenten worden vervolgens gedetecteerd door een quadrupool-massaspectrometer. De ruwe gegevens verkregen via GCMS-analyse worden verwerkt en gepresenteerd als een chromatogram voor elk monster.Individuele monomeren die overeenkomen met verschillende chromatografische pieken worden geïdentificeerd aan de hand van hun specifieke massaspectra. In GC-retentietijden worden de hoeveelheden van individuele monomeren bepaald met behulp van de interne standaardmethode van kwantificering, waardoor vergelijkingen van monomeren abundantie en compositie tussen monsters mogelijk zijn. Hier worden overlay-chromatogrammen getoond van representatieve analyses van monomeren, vrijgemaakt uit bladweefsel van een konijnenabces dat overeenkomt met het wildtype en twee mutante allelen van een gen dat codeert voor een P450-mono-oxygenase enzym, waarbij duidelijk verschillende monomerische profielen zichtbaar zijn.Onze resultaten tonen significante verschillen aan in de abundantie van drie belangrijke cutine-monomeren in wilde-type en mutante Arabidopsis-planten. Dit protocol is een robuuste methode voor het analyseren van de samenstelling van plantenlipide polyesters door de isolatie, identificatie en kwantificering van hun bestanddelen. De procedure is schaalbaar en kan gemakkelijk worden aangepast om grote hoeveelheden van diverse plantmaterialen te verwerken, waaronder wortels, zaden, bladeren en andere complete weefsels.Deze techniek is toepasbaar op studies die de biosyntheseregulatie en distributie van cutine en suberine in hogere planten onderzoeken.

isolation-compositional-analysis-plant-cuticle-lipid-polyester

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De plant cuticula is een wasachtige buitenste laag met planten die een primaire rol in het waterbeheer heeft, maar is ook een belangrijke barrière tegen het binnendringen van pathogene micro-organismen. In deze video, tonen we de analyse van de plant cuticula mutanten geïdentificeerd door vooruit en reverse genetics benaderingen.

Het gebruik van Arabidopsis mutanten eceriferum naar Plant Nagelriem Biosynthese Explore

Plantaardige biomassa is een belangrijke koolstof-neutrale hernieuwbare grondstof die gebruikt kunnen worden voor de productie van biobrandstoffen. Plantaardige biomassa bestaat voornamelijk uit celwanden, een structureel complex composietmateriaal genoemd lignocellulose. Hier beschrijven we een protocol voor een uitgebreide analyse van de inhoud en de samenstelling van de polyfenolische lignine.

Uitgebreide analyse van de samenstelling van de celwanden (lignocellulose biomassa) Deel I: Lignine

Plantaardige biomassa is een belangrijke koolstof-neutrale hernieuwbare grondstof die gebruikt kunnen worden voor de productie van biobrandstoffen. Plantaardige biomassa bestaat voornamelijk uit celwanden, een structureel complex composietmateriaal genoemd lignocellulose. Hier beschrijven we een protocol voor een uitgebreide analyse van de inhoud en de samenstelling van de muur afgeleid koolhydraten.

Uitgebreide analyse van de samenstelling van de celwanden (lignocellulose biomassa) Deel II: Koolhydraten

Samenstelling van de polaire lipiden extracten en de vetzuursamenstelling van de individuele glycerolipids worden bepaald in een eenvoudige en robuuste lipide profilering experiment. Voor dit doel worden glycerolipids geïsoleerd door dunnelaagchromatografie en onderworpen aan transmethylation van hun acylgroepen. Fatty acyl methylesters worden gekwantificeerd door middel van gas-vloeistofchromatografie.

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling door Thin Layer Chromatography (TLC) Samen met de gas-vloeistofchromatografie (GLC)

Antenne-installaties organen zijn beschermd door de cuticula, een supramoleculaire biopolyester-wax montage. We presenteren protocollen bij selectieve verwijdering van epi-en intracuticular was van tomaat fruit nagelriemen op moleculaire en microniveau door solid-state NMR en atomic force microscopie, respectievelijk te controleren, en om de verknoping capaciteit van gemanipuleerde cuticulair biopolyesters te beoordelen.

Isolatie en Biofysische Studie van Fruit nagelriemen

Isolatie en karakterisering van het lipide Een domein van lipopolysaccharide (LPS) van gram-negatieve bacteriën geeft inzicht in celoppervlak gebaseerde mechanismen van resistentie tegen antibiotica, bacteriële overleving en fitness, en hoe chemisch diverse lipide Een moleculaire species verschillend moduleren gastheer aangeboren immuunrespons.

Isolatie en chemische karakterisering van Lipid A van Gram-negatieve bacteriën

De bacteriële celwand bestaat uit peptidoglycan, een macromoleculair netwerk van suikerstrengen gekruist door peptiden. Ultra Performance Liquid Chromatography biedt een hoge resolutie en doorvoer voor nieuwe ontdekkingen van peptidoglycan samenstelling. We presenteren een procedure voor de isolatie van celwanden (sacculi) en hun daaropvolgende voorbereiding voor analyse via UPLC.

Isolatie en bereiding van bacteriële celwanden voor compositorische analyse door Ultra Performance Liquid Chromatography

Hier presenteren we een protocol voor het uitvoeren van ethanol extractie van lignine uit verschillende bronnen van biomassa. Het effect van de extractie-voorwaarden op de opbrengst van de lignine en β-O-4 inhoud worden gepresenteerd. Selectieve depolymerization wordt uitgevoerd op de verkregen Ligninen verkrijgen van hoge aromatische monomeer producten.

Extractie van lignine met een hoog gehalte van de β-O-4 door milde Ethanol extractie en het Effect daarvan op het rendement van de Depolymerization

In reptielen zijn huid lipiden van soortgenoten cruciaal voor seksuele signalering, met potentiële gebruik in beheer van invasieve soorten. Hier beschrijven we protocollen voor het extraheren van huid lipiden uit schuur huid of hele dieren, bepalen en analyseren van de totale lipide-massa en de lipiden met behulp van fractionering via kolom-chromatografie te scheiden.

Chemische isolatie, kwantificering en scheiding van lipiden van de huid van reptielen

Een snel en efficiënt protocol wordt gepresenteerd voor de isolatie van plastoglobule lipidedruppels geassocieerd met verschillende fotosynthetische organismen. De succesvolle bereiding van geïsoleerde plastoglobulen is een cruciale eerste stap die voorafgaat aan gedetailleerde moleculaire onderzoeken zoals proteomische en lipidomische analyses.

Plastoglobule Lipid Droplet Isolation van plantaardig bladweefsel en cyanobacteriën

Leer een betrouwbare methode voor het analyseren van lipidpolyesters in plantenweefsels via depolymerisatie en GC-MS. Deze techniek helpt onderzoekers bij het bestuderen van cutinebiosynthese en plantenfysiologie.

Isolatie en analyse van de samenstelling van de Plant Nagelriem Lipid Polyester Monomeren

Meer video's verkennen