Name: PAR-Klip - RNA Cilt Proteinler Transcriptome geniş Cilt Siteleri Belirlemek Amacıyla Bir Yöntem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Öğrenin, fotoreaktif nükleozid analogları ve UV çapraz bağlama kullanarak RNA bağlayıcı proteinlerin transkriptom genelindeki bağlanma bölgelerini nasıl belirleyebilirsiniz. Bu yöntem, RNA tanıma elemanlarını ve bağlanma tercihlerini tanımlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz yararlı tartışmalar için Tuschl laboratuvar üyeleri teşekkür ederiz. MH Deutscher Akademischer Austauschdienst (DAAD) tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma, İsviçre Ulusal Fonu Hibe MZ # 3100A0-114.001 tarafından desteklenen; TT bir HHMI araştırmacı, ve onun laboratuvarda çalışma NIH hibe GM073047 ve MH08442 ve Starr Vakfı tarafından desteklenmiştir.

Aşağıdaki protokol HEK293 hücreleri ifade BAYRAK / doksisiklin ile indüksiyon üzerine IGF2BP1 HA-etiketli PAR-Klip prosedürü açıklamaktadır. Biz anti-BAYRAK antikor immunoprecipitation için kullanacaktır. PAR-Klip immunoprecipitation için etkin bir antikor varsa, herhangi bir hücre hattı ilgi RNA bağlayıcı protein (RBP) etiketsiz endojen saptanabilir düzeyleri, ifade çalışacaktır. Genişleyen Hücreler <ol><li> Besi FlpIn-HEK293/TO/FLAG/HA-IGF2BP1 hücreleri genişletin. Biz 100-400 x 10 6 hücre (yaklaşık 10-40 15 cm hücre kültürü plakaları) arasında bir başlangıç ​​noktası olarak kullanmanızı öneririz. Yaklaşık% 80 confluency büyütün. </li><li> Crosslinking 14 saat önce doğrudan hücre kültür ortamına 100 mcM bir final konsantrasyonu ((1:1000) 1 M 4-thiouridine stok solüsyonu v / v) a) 4-thiouridine eklemek ve b) BAYRAK / HA ifadesi neden doksisiklin (10 mg / ml doksisiklin stok solüsyonu 1:10,000 v / v) 1 mcg / ml ilave edilerek IGF2BP1 etiketli. NOT: 4-thiouridine yerine 6-thioguanosine 100 mcM kullanabilirsiniz. </li></ol> UV-Crosslinking <ol><li> Plaka başına 10 ml buz gibi soğuk PBS ile hücreler bir kez yıkayın ve tamamen kaldırmak PBS. </li><li> Buz ve Stratalinker 2400 0.15 J / cm 2 365 nm UV ışığı (Stratagene) veya benzeri bir cihaz ile ortaya çıkarılan ışın tedavisi ile bir tepsi yerleştirin plakalar. </li><li> Plaka, 50 ml santrifüj tüplerine transferi başına 1 ml PBS içinde lastik bir polis memuru ile hücreleri kazıyın ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 xg'de santrifüj yoluyla toplamak ve supernatant atın. 100 x 10 6 HEK293 hücreleri (10 x 15 cm plakaları) yaklaşık verecektir. Islak hücre pelet 1 ml. </li><li> (Isteğe bağlı) hücre parçalama ile doğrudan devam etmek istemiyorsanız, şok -80 sıvı azot ve mağaza hücre pelletini ° C dondurmak Hücre pelletleri en az 12 ay süreyle saklanabilir. </li></ol> Hücre parçalama ve RNaseT1 sindirimi <ol><li> 1x NP40 lizis tamponu 3 cilt halinde çapraz hücreleri hücre pelletini alın ve 10 dakika buz üzerinde inkübe. </li><li> 15 dakika 13.000 xg'de santrifüj 4 Berrak hücreli lizat ° C </li><li> 0.2 mikron membran şırınga filtresi (Pall Acrodisc veya eşdeğeri) üzerinden filtreleme lizat temizleyin. </li><li> 1 U / ul ve 15 dakika için bir su banyosunda inkübe at 22 ° C arasında nihai bir konsantrasyona RNaz T1 (Fermentas, 10.000 U / ml) Devam etmeden önce 5 dakika boyunca buz üzerinde sonradan Cool tepki. </li></ol> Immunoprecipitation kurtarma ve çapraz hedef RNA parçaları Manyetik ayırıcı Manyetik boncuklar kurumasını önlemek için numune hazırlama boyunca bu yönergeleri izleyin. <ol><li> 1 2 dakika boyunca manyetik standında boncuklar içeren tüp yerleştirin. </li><li> Tüp tüp manyetik ayırıcı açıkken tampon ekleyin. </li><li> Tüp kapağı, manyetik ayırıcı kaldırmak ve boncuklar tekrar süspansiyon. Tüp parmağınızla hafifçe vurarak boncuklar tekrar süspansiyon veya 5 6 vortexer kullanabilirsiniz. </li><li> Tüp kap kalır herhangi bir boncuk toplamak için kısaca santrifüjleyin. </li><li> Gerektiği gibi 1 ile 4 arasındaki adımları tekrarlayın. </li></ol> Manyetik boncuk hazırlanması <ol><li> 10 ul (Invitrogen) Dynabeads Protein G manyetik partiküller ml başına hücre lizat Devret (olması gereken tipik bir deney için yaklaşık 40 50 boncuk ul) 1.5 ml mikrofuge'de tüp. Boncuk iki kez 1 ml sitrat-fosfat tamponu ile yıkayın. </li><li> Sitrat-fosfat tamponu boncuk süspansiyonu orijinal hacmine göre iki kat daha fazla hacim olarak yeniden süspanse edin. </li><li> 0.25 mikrogram anti-BAYRAK M2 monoklonal antikor (Sigma), oda sıcaklığında 40 dakika süreyle dönen bir tekerlek başına ml süspansiyon ve inkübe ekleyin. </li><li> Bağlanmamış antikor kaldırmak için 1 ml sitrat-fosfat tamponu boncuk iki kez yıkayın. </li><li> Boncuk boncuk süspansiyonu orijinal hacmine göre sitrat-fosfat tamponu iki kez hacmi tekrar </li></ol> Immunoprecipitation (IP), ikinci RNaz T1 sindirim, ve Defosforilasyon <ol><li> 20 ml başına kısmi RNaz T1 tedavi hücre lizat taze hazırlanmış antikor konjuge manyetik boncuk ul ekleyin ve 4, 1 saat için dönen bir tekerlek üzerinde 15 ml santrifüj tüpleri inkübe ° C </li><li> 15 ve 50 ml santrifüj tüpleri (Invitrogen) bir manyetik parçacık toplayıcı manyetik boncuk toplayın ve 1,5 ml mikrofuge'de tüpler transfer. </li><li> IP yıkama tamponu 1 ml boncuk, 3 kere yıkayın. </li><li> 100 U / ml bir final konsantrasyon RNaseT1 (Fermentas, 10.000 U / ml) ekleyin ve 15 dakika süreyle su banyosunda 22 boncuk süspansiyon inkübe ° C. Buz üzerinde daha sonra soğutun5 dk. </li><li> 1 ml yüksek tuz yıkama tamponu boncuk, 3 kere yıkayın. </li><li> Defosforilasyon tampon 1 hacmi içinde süspanse edin boncuk </li><li> 0.5 U / ml nihai konsantrasyonu buzağı intestinal alkalen fosfataz (CIAP NEB) ekleyin ve 10 dakika süreyle askıya inkübe 37 ° C </li><li> Fosfataz yıkama tamponu 1 ml boncuk iki kez yıkayın </li><li> DTT (DTT konsantrasyonu enzimatik reaksiyon için gerekli olan manyetik boncuklar zarar verecek kadar yüksek) olmadan iki kez polinükleotid kinaz (PNK) tampon boncuk yıkayın. </li><li> PNK tampon bir orijinal boncuk hacmi yeniden süspanse boncuk </li></ol> Immunoprecipitated proteinlerin çapraz RNA segmentleri, Radyoaktif <ol><li> Yukarıda açıklanan boncuk süspansiyonu, tek bir özgün boncuk hacmi 1 U / ul 0.5 μCi / ml ve T4 PNK nihai konsantrasyonu (NEB) Υ-32 P-ATP eklemek . 37 30 dakika süspansiyon inkübe ° C </li><li> 100 mcM son bir konsantrasyon elde etmek ve 37 başka bir 5 dakika boyunca inkübe non-radyoaktif ATP ° C </li><li> DTT olmadan PNK tampon 800 ul manyetik boncuk 5 kez yıkayın. </li><li> SDS-PAGE yükleme tamponu 70 ul boncuk süspanse edin. </li></ol> SDS-PAGE jel dilimleri ve çapraz RNA-protein kompleksleri, electroelution <ol><li> Radyoaktif süspansiyon bir ısı bloğu 5 dakika 95 ° C'de denatüre ve çapraz bağlı RNA ve vorteks immunoprecipitated RBP bırakın. </li><li> Ayırıcı manyetik boncuk çıkarın ve temiz bir 1.5 ml mikrofuge'de tüp süpernatantı transfer. </li><li> 40 süpernatantı ul için iyi bir Novex Bis-Tris% 4-12 (Invitrogen) prekast poliakrilamid jel yerleştirin ve 55 dakika süreyle 200 jel çalıştırmak V. </li><li> Jel odasının sökün ve bir plaka üzerine monte bırakarak, jel sökmeye. Phosphorimager kağıt çıktısı jel uyum kolaylaştırmak için, jel dört bir köşesinden üç asimetrik üç küçük radyoaktif jel parçaları implante tavsiye ederiz. Radyoaktif jel parçaları önceden radyoaktif sentetik oligonükleotidler arındırmak için kullanılan jeller toplanabilir. Kontaminasyonu önlemek için plastik film (örneğin, Saran wrap) jel sarın. </li><li> 1 saat blanked phosphorimager ekran jel ortaya çıkarmak ve bir phosphorimager görselleştirmek. </li><li> Yönelim implante jel parçaları kullanılarak phosphorimager çıktının üst jel hizalayın. RBP beklenen boyutu (IGF2BP1, yaklaşık 75 kDa) karşılık gelen ve D-Tube diyalizer Midi Tüp transfer ve 800 ul 1x SDS çalışan tampon bantları kesin. </li><li> 2 saat için 100 V tampon çalışan 1x SDS çapraz RNA RBP kompleksi Electroelute jel eksize ve üreticinin talimatlarına göre 800 ul SDS çalışan tampon D-Tube diyalizer Midi (Novagen) electroeluted. </li></ol> Proteinaz K sindirimi <ol><li> Proteinaz K (Roche), son konsantrasyonu 1.2 mg / ml 'lik bir ek tarafından takip electroeluate açısından eşit bir ses, 2x Proteinaz K Tampon ekleyin. 55 az 30 dakika boyunca inkübe ° C. </li><li> Asidik fenol / kloroform / IAA çıkarımı (25:24:1, pH 4.0), kloroform ekstraksiyon takip RNA kurtarın. 1 ul glikojen (10 mg / ml stok) 3 hacim etanol eklenerek RNA hızlandırabilir. Pelet 10.5 ul suda eritin. </li></ol> cDNA kütüphanesi hazırlama ve derin sıralama Başlangıçta küçük düzenleyici RNA'lar 19 klonlama açıklanan standart bir cDNA kütüphanesi hazırlık protokolü aracılığıyla kurtarılan RNA taşır. Kurtarılan RNA 10.5 ul kullanarak 20 ul ölçekte açıklandığı gibi ilk adım, 3 'adaptörü ligasyonu, gerçekleştirildi. Solexa sıralama adaptörü açıklanan ayarlar kullanın. Iyileşti RNA miktarını bağlı olarak, ekler olmadan 5'-adaptör-3'-adaptör ürünleri, ek PCR bantları gibi cDNA amplifikasyonu sonra tespit edilebilir. Bu gibi durumlarda, beklenen büyüklüğü% 3 NuSieve uzun PCR ürününün tüketim düşük erime noktası agaroz jel, Solexa teknolojisini kullanarak GelElute kiti (Qiagen) ve sırası ile jel parçalarından PCR ürünü Zehir. Bir Solexa sıralama çalıştırmak genellikle sırası 6 ve 10 milyon arasında tanıyor, RNA bağlayıcı proteinlerin bağlanma yerleri bir transcriptome geniş kapsama alanı için yeterli olduğunu okur. Biyoinformatik analizi Dikkatli biyoinformatik analiz dizisi dizisi vs çevrilmemiş kodlama ihtiyaçlarına incelenen RBP, RNA tanıma elemanı, RBP tercih edilen bağlayıcı bölgeleri (exonic vs intronik gibi RNA bağlayıcı siteleri, anlamlı anlayışlar elde etmek için yapılması gereken okur dizisi). Okuma sırası genom ve EST veritabanlarının karşı uyumlu hale getirilmesi gerekir. Biz genellikle okuma mappibir uyumsuzluk, ekleme veya silme sırası kümeleri oluşturmak için benzersiz genom ng daha sonra analiz edilebilir okur. Kümelenmiş sıralı frekans karakteristik mutasyonlar, C geçişler 6-SG kullanırken bir geçişler 4-SU ve G kullanırken, T okur başarıyla çapraz dizilerinin göstergesidir. Bizim tecrübelerimize göre bir arka plan mutasyon oranı yaklaşık% 20 4-SU ile etiketlenmiş uncrosslinked RNA'lar göstermektedir. Bu oran yaklaşık artar. Crosslinking üzerine% 50-80. Biyoinformatik analizi ayrıntılı bir açıklama Hafner ve arkadaşları tarafından yayın Ek malzeme bulundu. 18 İsteğe bağlı adımlar Toplam RNA içine 4-thiouridine dahil düzeylerinin belirlenmesi 100 mcM hasattan önce 4SU 16 saat ile desteklenmiş ortamda büyüyen sonra stabil bir şekilde ilgi RBP ifade hücre hattı toplam RNA izole edin. Kontrol olarak, hasat hücreler 4SU ilave edilmeden büyüdü. Ayrıca üreticinin talimatlarına izleyerek yıkanmış hücre granül Trizol reaktifi (Sigma) 3 cilt toplam RNA izole edin. Ayrıca üreticinin protokole göre Qiagen RNeasy kullanarak toplam RNA arındırmak oldu. 4SU, RNA izolasyonu ve analizi sırasında oksitlenmeyi önlemek için, yıkama tamponları ve enzimatik adımdan sonraki 0.1 mM dithiothreitol (DTT) ekleyin. Digest ve HPLC analizi için tek nükleosidlerin A'ya defosforilize toplam RNA 20 önce nitelendirdi. Kısaca, 30 ul hacmi, 37, 16 saat, toplam RNA saflaştırılmış 40 mikrogram idi inkübe ° C 0.4 U bakteriyel alkalin fosfataz (Biyokimyasal Worthington) ve 0.09 U yılan zehiri fosfodiesteraz (Worthington Biyokimyasal). Bir referans standart olarak, 4SU etiketli sentetik RNA (standart CGUACGCGGAAUACUUCGA (4SU) U) ve enzimatik sindirimi tamamlamak için maruz kullanın. Bir Supelco Discovery C18 (gümrüklü faz silika 5 mcM parçacık, 250 x 4.6 mm) ters faz kolon (Bellefonte PA, USA) HPLC ile ribonucleosides çıkan karışımları ayırın. HPLC tamponlar% 3 asetonitril (A) ve% 90 su asetonitril (B) 0,1 M TEAA. 15 dakika, 20 dakika 0 -% 10 B, 30 dakika 10 ila% 100 B: 0% B izokratik degrade kullanın. Arasında uygulanan yıkama HPLC kolon temizlemek için çalışan bir 5 dakika% 100 B uygulayın. Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/2034/2034fig1.jpg" alt="Şekil 1"> Şekil 1 (sağ panel) hücre hatları BAYRAK / 4-SU ve 6-SG ile IGF2BP1 HA etiketli ifade ile yapılan bir PAR-Klip temsili bir sonuç göstermektedir. IGF2BP1 6-SG crosslinking verimliliği 4-SU crosslinking verimliliği daha düşük olduğunu unutmayın. Düşük crosslinking verimliliği daha yüksek bir arka planda bol hücresel RNA parçaları elde dizilerinin neden olacaktır ve bu nedenle daha az verimli photoreactive nükleosidlerin kullanırken deneme ölçeklendirme düşünmelisiniz. Şekil 1 sol panelindeki potansiyel geleneksel UV 254 nm crosslinking göre PAR-Klip için kullanılan olabilir farklı photoreactive üridin analogları kullanarak bir karşılaştırma gösterir. Doğru uzunlukta radyoaktif bant yoğunluğu PAR-Klip deney küçük bir RNA sıralama protokolü (küçük cDNA kütüphanesi hazırlamak için adım adım açıklaması ile çalıştı ve taşımak için yeterli RNA izole olup olmadığını iyi bir fikir verir RNA'lar sıralama) 19 bulunabilir. 6-SG kullanarak bir geçişler 4-SU ve G ile C geçişler için sıralı okuma, T karakteristik mutasyonlar, frekans, başarılı bir şekilde çapraz dizilerinin göstergesidir. Bizim tecrübelerimize göre bir arka plan mutasyon oranı yaklaşık% 20 4-SU ile etiketlenmiş uncrosslinked RNA'lar göstermektedir. Bu oran yaklaşık artar. Crosslinking üzerine% 50-80.

<ol><li>Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+regulons%3A+coordination+of+post-transcriptional+events%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA regulons: coordination of post-transcriptional events.</a> Nat. Rev. Genet. 8 (7), 533-533 (2007).</li>
<li>Tenenbaum, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+mRNA+subsets+in+messenger+ribonucleoprotein+complexes+by+using+cDNA+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. 97 (26), 14085-14085 (2000).</li>
<li>Gerber, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+mRNAs+associated+with+the+translational+regulator+PUMILIO+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of mRNAs associated with the translational regulator PUMILIO in Drosophila melanogaster.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. 103 (12), 4487-4487 (2006).</li>
<li>Lopez de Silanes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+target+RNA+motif+for+RNA-binding+protein+HuR%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Identification of a target RNA motif for RNA-binding protein HuR.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. 101 (9), 2987-2987 (2004).</li>
<li>Greenberg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet+light-induced+crosslinking+of+mRNA+to+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet light-induced crosslinking of mRNA to proteins.</a> Nucl. Acids Res. 6 (2), 715-715 (1979).</li>
<li>Wagenmakers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-linking+of+mRNA+to+proteins+by+irradiation+of+intact+cells+with+ultraviolet+light%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Cross-linking of mRNA to proteins by irradiation of intact cells with ultraviolet light.</a> Eur. J. Biochem. 112 (2), 323-323 (1980).</li>
<li>Mayrand, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+nuclear+ribonucleoprotein%3A+identification+of+proteins+in+contact+with+poly%28A%29%2B+heterogeneous+nuclear+RNA+in+living+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Structure of nuclear ribonucleoprotein: identification of proteins in contact with poly(A)+ heterogeneous nuclear RNA in living HeLa cells.</a> The Journal of Cell Biology. 90 (2), 380-380 (1981).</li>
<li>Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+heterogeneous+nuclear+RNA-protein+complexes+in+vivo+with+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of heterogeneous nuclear RNA-protein complexes in vivo with monoclonal antibodies.</a> Mol. Cell. Biol. 4 (6), 1104-11 (1984).</li>
<li>Adam, S. A., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+proteins+associated+with+mRNA+and+hnRNA+in+infected+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus proteins associated with mRNA and hnRNA in infected HeLa cells.</a> J. Virol. 61 (10), 3276-3276 (1987).</li>
<li>Ule, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLIP+identifies+Nova-regulated+RNA+networks+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain.</a> Science. 302 (5648), 1212-1212 (2003).</li>
<li>Licatalosi, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HITS-CLIP+yields+genome-wide+insights+into+brain+alternative+RNA+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing.</a> Nature. 456 (7221), 464-464 (2008).</li>
<li>Yeo, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA+code+for+the+FOX2+splicing+regulator+revealed+by+mapping+RNA-protein+interactions+in+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">An RNA code for the FOX2 splicing regulator revealed by mapping RNA-protein interactions in stem cells.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 16 (2), 130-130 (2009).</li>
<li>Sanford, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+factor+SFRS1+recognizes+a+functionally+diverse+landscape+of+RNA+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Splicing factor SFRS1 recognizes a functionally diverse landscape of RNA transcripts.</a> Genome Res. 19 (3), 381-381 (2009).</li>
<li>Granneman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protein+binding+sites+on+U3+snoRNA+and+pre-rRNA+by+UV+cross-linking+and+high-throughput+analysis+of+cDNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Identification of protein binding sites on U3 snoRNA and pre-rRNA by UV cross-linking and high-throughput analysis of cDNAs.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. , (2009).</li>
<li>Guil, S., Caceres, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifunctional+RNA-binding+protein+hnRNP+A1+is+required+for+processing+of+miR-18a%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The multifunctional RNA-binding protein hnRNP A1 is required for processing of miR-18a.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 14 (7), 591-591 (2007).</li>
<li>Chi, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Argonaute+HITS-CLIP+decodes+microRNA-mRNA+interaction+maps%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Argonaute HITS-CLIP decodes microRNA-mRNA interaction maps.</a> Nature. 460 (7254), 479-479 (2009).</li>
<li>Zisoulis, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+discovery+of+endogenous+Argonaute+binding+sites+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Comprehensive discovery of endogenous Argonaute binding sites in Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. , (2010).</li>
<li>Hafner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+identification+of+RNA-binding+protein+and+microRNA+target+sites+by+PAR-CLIP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP.</a> Cell. , (2010).</li>
<li>Hafner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+microRNAs+and+other+small+regulatory+RNAs+using+cDNA+library+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Identification of microRNAs and other small regulatory RNAs using cDNA library sequencing.</a> Methods. 44 (1), 3-3 (2008).</li>
<li>Andrus, A., Kuimelis, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Base+composition+analysis+of+nucleosides+using+HPLC%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Nucleic+Acid+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Base composition analysis of nucleosides using HPLC.</a> Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. Chapter 10 (Unit 10.6), (2001).</li>
</ol>

TT Alnylam İlaç kurucularından ve bilimsel danışmanı ve Regulus Therapeutics bir danışman.

Tamponlar ve reaktifler Büyüme orta HEK293 hücreleri <ul><li> DMEM </li><li> % 10 FBS </li><li> 2 mM L-Glutamine </li><li> 100 U / ml penisilin </li><li> 100 U / ml streptomisin </li><li> 100 mg / ml hygromycin </li><li> 15 mcg / ml blasticidin </li></ul> 4-thiouridine stok solüsyonu (1 M) <ul><li> 260,27 mg 4-thiouridine </li><li> 1 ml DMSO </li></ul> Doksisiklin stok (10 mg / ml) <ul><li> 10 mg doksisiklin </li><li> 1 ml DMSO </li></ul> 1x NP40 lizis tamponu DTT ve proteaz inhibitörleri olmadan 5x tampon stok hazırlayın. DTT ve proteaz inhibitörü doğrudan deneyden önce ekleyin. <ul><li> 50 mM HEPES, pH 7.5 </li><li> 150 mM KCl </li><li> 2 mM EDTA </li><li> 1 mM NaF </li><li> % 0.5 (v / v) NP40 </li><li> 0,5 mM DTT </li><li> tam EDTA içermeyen proteaz inhibitörü kokteyl (Roche) </li></ul> Sitrat-Fosfat tampon <ul><li> 4.7 g / L sitrik asit </li><li> 9.2 g / l Na 2 HPO 4 </li><li> pH 5.0 </li></ul> IP-yıkama tamponu <ul><li> 50 mM HEPES-KOH, pH 7.5 </li><li> 300 mM KCl </li><li> 0.05% (v / v) NP40 </li><li> 0.5 mM DTT (deneyden önce doğrudan eklemek) </li><li> tam EDTA içermeyen proteaz inhibitörü kokteyl (Roche) (doğrudan deney eklemeden önce) </li></ul> Yüksek tuz yıkama tamponu <ul><li> 50 mM HEPES-KOH, pH 7.5 </li><li> 500 mM KCl </li><li> 0.05% (v / v) NP40 </li><li> 0.5 mM DTT (deneyden önce doğrudan eklemek) </li><li> tam EDTA içermeyen proteaz inhibitörü kokteyl (Roche) (deneyden önce doğrudan eklemek) </li></ul> Defosforilasyon tampon <ul><li> 50 mM Tris-HCl, pH 7.9 </li><li> 100 mM NaCl </li><li> 10 mM MgCl 2 </li><li> 1 mM DTT </li></ul> Fosfataz yıkama tamponu <ul><li> 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 </li><li> 20 mM EGTA </li><li> % 0.5 (v / v) NP40 </li></ul> DTT olmadan polinükleotid kinaz (PNK) tampon <ul><li> 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 </li><li> 50 mM NaCl </li><li> 10 mM MgCl 2 </li></ul> PNK tampon <ul><li> 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 </li><li> 50 mM NaCl </li><li> 10 mM MgCl 2 </li><li> 5 mM DTT </li></ul> SDS PAGE yükleme tamponu <ul><li> % 10 gliserol (v / v) </li><li> 50 mM Tris-HCl, pH 6,8 </li><li> 2 mM EDTA </li><li> % 2 SDS (w / v) </li><li> 100 mM DTT </li><li> % 0.1 Bromophenol Mavi </li></ul> 2x Proteinaz K tampon <ul><li> 100 mM Tris-HCl, pH 7.5 </li><li> 150 mM NaCl </li><li> 12,5 mm EDTA </li><li> % 2 (w / v) SDS </li></ul>

par-klip - rna cilt proteinler transcriptome geniş cilt siteleri belirlemek amacıyla bir yöntem

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transkript yüzlerce RNA bağlayıcı proteinler (RBPs) ve microRNA içeren, genellikle bağımlı bir hücre tipi ifade ribonükleoprotein kompleksleri (miRNPs) ile etkileşim transkripsiyon sonrası gen düzenlemeye tabi Anlamak için bu RNA bağlayıcı faktörlerin etkileşimi bireysel transkript, in vivo protein-RNA etkileşimleri 1 gerekli olan yüksek çözünürlüklü haritalar yönetmelik nasıl etkiler. Genetik, biyokimyasal ve hesaplama yaklaşımları bir arada genellikle RNA RBP veya RNA-RNP etkileşimleri belirlemek için uygulanır. Immunopurified RBPs ile ilişkili RNA&#39;lar mikroarray (RIP-Chip) 2 transcriptome bir seviyede hedefler tanımlar, ancak uygulaması, kinetik istikrarlı etkileşimler ve sadece nadir durumlarda 3,4 RBP tanıma elemanı (RRE tanımlamanıza olanak sağlar karakterizasyonu ile sınırlıdır Uzun hedef RNA içinde). Daha doğrudan RBP hedef site bilgileri, in vivo UV crosslinking 5,6 çapraz RNA segment ve cDNA sıralama (CLIP) 10 izolasyonu takip immunoprecipitation 7-9 ile birleştirerek elde edilir . CLIP 11-17 RBPs bir takım hedefleri tanımlamak için kullanılır oldu. Ancak UV 254 nm RNA-protein çapraz bağlanma, düşük verimlilik, CLIP sınırlıdır ve çapraz bağ yerini zor arka planı olmayan-çapraz UV-çapraz hedef RNA segmentlerinde ayrı, sıralı çapraz parçaları içinde kolayca tanımlanabilir. RNA aynı zamanda örnek mevcut parçaları. Biz, yüksek çözünürlük ve hücresel RBPs ve miRNPs transcriptome çapında bağlayıcı siteleri belirlemek için güçlü bir hücre tabanlı crosslinking yaklaşım geliştirdi ki dönem PAR-Klip (Photoactivatable ribonükleozit-Geliştirilmiş Crosslinking ve Immunoprecipitation) (Şekil 1A anahat yöntemi). Bu yöntem, canlı hücreler tarafından 4-thiouridine (4-SU) ve 6-thioguanosine (6-SG) olarak photoreactive ribonükleozit analogları, doğmakta olan RNA transkript içine eklenmesi dayanmaktadır. 365 nm UV ışık hücreleri tarafından Işınlama etkileşim RBPs photoreactive nükleozid etiketli hücresel RNA&#39;lar verimli crosslinking neden olur. Ilgi RBP Immunoprecipitation çapraz ve coimmunoprecipitated RNA izolasyonu ile takip edilmektedir. Izole RNA, cDNA kütüphanesi dönüştürülür ve derin Solexa teknoloji kullanarak sıralı. CDNA kütüphaneleri PAR-Klip tarafından hazırlanan bir karakteristik özelliği de crosslinking kesin konumunu sıralı cDNA ikamet eden mutasyonların tespit edilebilir olmasıdır. sitidinin geçiş mutasyonlar adenozin guanozin 6-SG sonuçlarını kullanarak ise 4-SU kullanarak, çapraz dizileri timidin,. Çapraz dizileri mutasyonların varlığı mümkün bol hücresel RNA&#39;lar türetilen dizilerinin arka plan onları ayırmak için yapar. Çeşitli RNA bağlayıcı proteinler bir dizi yöntem Uygulama Hafner ve ark bildirilmiştir. 18

RNA transkript trans etkili RNA bağlayıcı proteinler (RBPs) çok sayıda aracılığı ile geniş posttranskripsiyonel düzenlemeye tabidir. Burada hassas ve transcriptome geniş bir ölçekte RBPs, RNA bağlayıcı siteleri tanımlamak için genellenememektedir bir yöntem mevcut.

PAR-Klip - RNA Cilt Proteinler Transcriptome geniş Cilt Siteleri Belirlemek Amacıyla Bir Yöntem

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Bu prosedürün genel amacı, RNA bağlayıcı proteinlerin veya RVP'lerin transkriptom geniş bağlanma bölgelerini belirlemektir. Bu, ilk olarak, yeni ortaya çıkan transkriptlerin in vivo etiketlenmesi için fotoreaktif nükleosit analogları kullanılarak gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, RNA ve RNA bağlayıcı proteinleri 365 nanometre UV ışığı ile çapraz bağlamaktır.Prosedürün üçüncü adımı, araştırılan RNA bağlayıcı proteini immüno-çökeltmek ve RNA'ya çapraz bağı geri kazanmaktır. Prosedürün son adımı, RNA'yı bir CD NA kütüphanesine ve derin diziye dönüştürmektir. Sonuç olarak, RVP'lerin transkriptom geniş bağlanma bölgelerini gösteren ve RNA tanıma elemanının tanımını ve bağlanma tercihlerini mümkün kılan sonuçlar elde edilebilir.Merhaba, benim adım New York'taki Rockefeller Üniversitesi'ndeki Tom SEL'in laboratuvarından Marcus Hoffner. Bugün, par dudak veya fotoable kaburga nükleoziti, analog, geliştirilmiş çapraz bağlama ve immünopresipitasyon adı verilen bir yöntem göstereceğiz. Laboratuvarımızda, RNA bağlayıcı proteinlerin ölçek bağlanma yerlerini ve bunların bağlanma motiflerini ve tercihlerini bir transkriptom üzerinde tanımlamak için bu prosedürü kullanıyoruz.Tamam, hadi başlayalım. İn vivo UV çapraz bağlama, laminer akış başlığında başlar. Bu protokolde steril teknik kullanılarak örnek model olarak etiketlenmiş IGF iki BP tek hücre kullanılacaktır.HEK 2 93 hücre kültürü ortamında 100 ila 400 kez 10 kez altıncı hücrelere kadar kullanarak, HA etiketli IGF etiketli IGF iki BP bayrağını kararlı bir şekilde ifade eden HEK 2 93 hücrelerini genişletin ve bunları yaklaşık %80 co akıcılığına kadar büyütün. Çapraz bağlanmadan 14 saat önce, hücreler tiyo üridin veya SU için doğrudan hücre kültürü ortamına fotoreaktif ribozit analoguna sahipti. Alternatif olarak, fotoreaktif ribozit indükleyici ekspresyonunun eklenmesini takiben altı inci gine veya altı SG kullanılabilir, HA etiketli IGF iki BP, biri doksisiklin hücrelerinin eklenmesiyle daha sonra hücre inkübatörde gece boyunca inkübe edilir.Ardından, büyüme ortamını boşaltın. Daha sonra hücreleri bir kez plaka başına 10 mililitre buz gibi soğuk fosfat tamponlu tuzlu su ile yıkayın. Ardından PBS'yi boşaltarak tamamen çıkarın.Açıkta kalan plakaları buzlu bir tepsiye yerleştirin ve UV radyasyonunu takiben bir istifli bağlayıcı 2, 400 UV çapraz bağlayıcı veya eşdeğerinde 365 nanometre UV ışığı ile ışınlayın, hücreleri plaka başına bir mililitre PBS'de bir lastik polis memuru ile kazıyın. Hücreleri 50 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca 500 G'de santrifüjleyin. Süper adı atın ve hücre peletini koruyun.Bu noktada, hücre peletleri sıvı nitrojen içinde hızlı dondurulabilir ve en az 12 ay boyunca eksi 80 derecede saklanabilir. Prosedüre devam etmek için, reus peleti bir X NP 40 lizis tamponunun üç hacminde askıya alın ve 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Hücre lizatını dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 13.000 G'de santrifüjleme ile temizleyin.Santrifüjlemeyi takiben, lizatı beş mikronluk bir membran şırınga filtresinden süzerek daha da temizleyin. Son olarak, mikrolitre başına bir birimlik nihai konsantrasyona RNA'lar T ekleyin ve 15 dakika boyunca 22 santigrat derecede bir su banyosunda inkübe edin. Daha sonra, reaksiyonu buz üzerinde beş dakika soğutun.İn vivo UV çapraz bağlamayı takiben. Manyetik boncukları immünopresipitasyon için hazırlayın. Bir mil hücre lizatı başına 10 mikrolitre dyna boncuk protein G manyetik partikülünü 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.Daha sonra boncukları içeren tüpü bir ila iki dakika manyetik bir stand üzerine yerleştirin. Süpernatanı çıkarın ve manyetik ayırıcı üzerindeyken tüpe bir mililitre sitrat fosfat tamponu ekleyin. Ardından, tüpü kapatın ve boncukları yeniden askıya almak için numuneyi girdaplayın.Tüp kapağında kalan boncukları toplamak için kısa bir süre santrifüjleyin. Bu yıkamayı ilave bir mililitre sitrat fosfat tamponu ile tekrarlayın. Yıkama tekrarını takiben, boncukları ve sitrat fosfat tamponunu orijinal pancar süspansiyonu hacminin iki katı bir hacimde askıya alın.Ardından, bir mililitre beat süspansiyonu başına 0.25 miligram Anti-Flag M iki monoklonal antikor ekleyin. Süspansiyonu inkübasyondan sonra oda sıcaklığında 40 dakika boyunca dönen bir tekerlek üzerinde inkübe edin, boncukları daha önce tarif edildiği gibi bir mililitre sitrat fosfat tamponunda iki kez yıkayın, bu yıkama, yıkama Resus'u takiben herhangi bir bağlanmamış antikorun çıkarılmasına hizmet eder, boncukları askıya alın ve sitrat fosfat tamponu dörtten önce olduğu gibi. İmmünopresipitasyona başlamak için, taze hazırlanmış antikor konjuge manyetik boncukları, RNA'ların T one ile muamele edilmiş hücre lizatına ekleyin.Karışımı 15 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın ve dört santigrat derecede bir saat döndürün. İnkübasyondan sonra, manyetik boncukları toplayın, süpernatan yeniden süspanse boncukları bir mililitre IP yıkama tamponunda atın ve bunları 1.5 mililitre santrifüj tüplerine aktarın. Boncukları daha önce anlatıldığı gibi bir mililitre IP yıkama tamponunda iki kez yıkayın.Son yıkamadan sonra, boncukları IP yıkama tamponunun orijinal boncuk hacminde tekrar askıya alın. Ardından, mikrolitre başına 100 birimlik bir nihai konsantrasyona RNAT bir ekleyin. Boncuk süspansiyonunu 22 santigrat derece su banyosunda 15 dakika inkübe edin.Daha sonra süspansiyonu buz üzerinde beş dakika soğutun. Daha sonra, boncukları bir mililitre yüksek tuzlu yıkama tamponunda üç kez yıkayın. Daha sonra boncukları bir orijinal boncuk hacminde defosforilasyon tamponunda yeniden süspanse edin.Buzağı bağırsak alkalin fosfatazı mikrolitre başına 0.5 birimlik bir nihai konsantrasyona ekleyin ve süspansiyonu 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Boncukları bir mililitre fosfataz yıkama tamponunda iki kez ve ardından DTT olmadan polinükleotid kinaz veya PNK tamponunda iki kez daha yıkayın. Son olarak, boncukları bir orijinal boncuk hacmi PNK tamponunda yeniden askıya alın.Çapraz bağlı RNA'nın radyo etiketlemesine başlamak için. Taze hazırlanmış boncuk süspansiyonunun bir orijinal boncuk hacmine gama 32 PATP ve T dört PNK ekleyin. Süspansiyonu 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.Daha sonra, süspansiyona radyoaktif olmayan bir TP ekleyin ve 37 santigrat derecede beş dakika daha inkübe edin. Daha sonra manyetik boncukları DTT olmadan 800 mikrolitre PNK tamponu ile beş kez yıkayın. Son olarak, boncukları 70 mikrolitre SDS sayfasında yeniden askıya alın.Yükleme tamponu: İmmün çökeltilmiş RNA bağlayıcı proteinleri çapraz bağlı RNA ile denatüre etmek ve serbest bırakmak için radyo etiketi süspansiyonunu 95 santigrat derecede bir ısı bloğunda beş dakika inkübe edin. Daha sonra ayırıcı üzerindeki manyetik boncukları çıkarın ve süper natini temiz bir 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarın Novox bis triss dört ila %12 prekast poli akrilamid jelin oyuğuna 40 mikrolitre süet yükleyin ve jeli 200 voltta 55 dakika çalıştırın. Jel çalıştıktan sonra, jel haznesini sökün ve plakaları sökün, jelin fosfo görüntüleyici kağıt çıktısına hizalanmasını kolaylaştırmak için jeli bir plaka üzerinde takılı bırakın.Jel köşelerine asimetrik olarak üç küçük radyoaktif jel parçası implante edin. Kontaminasyonu önlemek için jeli Saran sargısı gibi plastik bir filme sarın. Jeli bir saat boyunca boş bir fosfo görüntüleyici ekranına ve bir fosfo görüntüleyiciye maruz bırakın.Ardından, yönlendirme için implante edilmiş jel parçalarını kullanarak jeli fosfo görüntüleyici çıktısının üzerine hizalayın. RNA bağlayıcı proteinin veya RBP'nin beklenen boyutuna karşılık gelen bantları kesin. Bantları bir dtu diyalizör MIDI tüpüne aktarın ve 800 mikrolitre çalışan bir arabellek elektro elüt ekleyin.Çapraz bağlı R-N-A-R-B-P kompleksi, üreticinin talimatlarına göre iki saat boyunca 100 voltta. Elektro elüsyonu takiben. Proteinaz K tamponu ve proteinaz K ekleyin, çözeltiyi 55 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.RNA'yı asidik fenol kloroform izoamil alkol ekstraksiyonu ve ardından bir kloroform ekstraksiyonu ile geri kazanın. Daha sonra bir mikrolitre glikojen ekleyin ve üç hacim etanol ekleyerek RNA'yı çökeltin. Son olarak elde edilen peleti 10,5 mikrolitre suda çözün.RNA geri kazanıldıktan sonra, onu standart bir CDNA kütüphanesi hazırlama protokolünden geçirin ve dizi okumalarının dikkatli bir biyoinformatik analizini yapın. HK 2 ile gerçekleştirilen bir par klip için temsili sonuçlar, H ha etiketli IGF, iki BP bir bayrak ifade eden 93 hücre, fotoreaktif nükleosit analogları ile gösterilir, dört SU ve altı SG, alternatif fotoreaktif ribozit altı SG'nin çapraz bağlama verimliliği genellikle dört su'dan daha düşüktür. Daha düşük çapraz bağlama verimliliği, bol miktarda hücresel RNA'nın parçalarından türetilen dizilerin daha yüksek bir arka planına neden olabilir ve bu nedenle deney için başlangıçta daha fazla hücre kullanılmalıdır.Farklı par klip fotoreaktif üridin analogları, burada görüldüğü gibi geleneksel UV 2 54 nanometre çapraz bağlama veya klips ile karşılaştırılır. UV 2 54 nanometre RNA proteini çapraz bağlama, sınırlı çapraz bağlama verimliliğine sahiptir. Uygun büyüklükteki radyoaktif bandın yoğunluğu, par klip deneyinin işe yarayıp yaramadığını ve küçük bir RNA dizileme protokolünü taşımak için yeterli RNA'nın izole edilip edilmediğini gösterir.Biyoinformatik analizi takiben dizilenmiş okumalardaki karakteristik mutasyonların frekansları, başarılı bir şekilde çapraz bağlı dizilerin göstergesidir. Bu mutasyonlar, dört SU kullanıldığında T iki C geçişi ve başarı kullanıldığında G iki A geçişidir. G. Park dudağının tanımlayıcı özelliği, geri kazanılan RNA'lardan hazırlanan CD NA kütüphanelerinde bulunan karakteristik bir mutasyon için skorlama yaparak çapraz bağın yerini elde etme olasılığıdır.Bu, özel olarak bağlı RNA'lardan türetilen sinyalin, bol miktarda hücresel RNA'nın birlikte izole edilmiş parçalarından türetilen dizilerin gürültüsünden kolayca ayrılmasına izin verir. Bu yüzden bugün size, özellikle RNA bağlayıcı proteinler tarafından tanınan RNA segmentlerini nasıl izole edeceğinizi gösterdik. Bu prosedürü yaparken.RNA'ların serbest çalışması önemlidir. İşte bu kadardı. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerde iyi şanslar.

par-clip-method-to-identify-transcriptome-wide-binding-sites-rna

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Pre-mRNA geçici doğası nedeniyle, izole etmek ve incelemek için zor...

İnsan pre-mRNA üzerinde Haritalama Ribonucleoproteins Hızlı Yüksek verim için Yöntemi (RNPs)

Transkript RNA bağlayıcı proteinlerin mekansal düzenleme, post-transkripsiyonel regülasyonunda önemli bir belirleyicisidir. Bu nedenle, bir RNA bağlayıcı protein bağlama bölgeleri hassas genom haritalama sağlar bireysel nükleotid çözünürlük UV crosslinking ve immunoprecipitation (iCLIP) geliştirdi.

iCLIP - Bireysel Nükleotid Çözünürlük protein-RNA Etkileşimleri Transcriptome geniş Haritalama

RNA-protein etkileşimleri birçok hücresel sürecin merkezinde yer alır. Burada, spesifik RNA'yı izole etmek ve onunla ilişkili yeni proteinleri tanımlamak için in vivo bir yöntemi açıklıyoruz. Bu, RNA'ların hücrede nasıl düzenlendiğine yeni bir ışık tutabilir.

Rapid Metodoloji tarafından Roman RNA Bağlayıcı Proteinler İzolasyon

Biz RNA bağlanıcı proteinler tanımlamak ve kendi RNA bağlayıcı bölgeleri UV-aracılı photocrosslinking ve kütle spektrometresi kullanılarak canlı hücrelerdeki eşlemek için bir protokol tanımlamak.

Kütle spektrometresi tabanlı kimlik RNA-bağlama bölgelerinin için numune hazırlama

Burada, Arabidopsis thaliana yaprak mezofil protoplastlarına uygulanan bir etkileşimli yakalama protokolünü sunuyoruz. Bu yöntem kritik olarak in vivo UV çapraz bağlanmaya dayanır ve fizyolojik bir ortamdan bitki mRNA'ya bağlanan proteinlerin izole edilmesine ve tanımlanmasına izin verir.

Bitki Protoplastlarından mRNA İnteraktom Yakalama

Her iki kodlama ve kodlamayan bağlayıcı proteinler tanımlamak için tıklatın Kimya destekli RNA-interactome yakalama (CARIC) strateji uygulamak için detaylı bir protokol RNA'ların sunulur.

Yakalama ve tıklama Kimya destekli RNA-interactome kullanarak RNA bağlanıcı proteinler tanımlaması (CARIC) strateji yakalama

Dizi özgüllüğü gen regülasyonu için çok önemlidir. Belirli dizileri tanıyan düzenleyici proteinler gen regülasyonu için önemlidir. Bu tür proteinler için fonksiyonel bağlama alanlarının tanımlanması zorlu bir biyolojik sorundur. RNA bağlayıcı protein için bağlayıcı bir alanın tanımlanması için yinelemeli bir yaklaşım burada açıklanmıştır ve tüm RNA bağlayıcı proteinler için geçerlidir.

Düzenleyici RNA Bağlayıcı Proteinler için Bağlayıcı Siteleri Belirlemek için Sıra Alanını Keşfetmek

Burada, testis 'teki RBP adaylarının büyük RNA hedeflerini belirlemek için bir eCLIP Protokolü sunuyoruz.

Gelişmiş Crosslinking Immünoprecipitation (eCLIP) fare testis protein bağlı RNA verimli tanımlaması için yöntem

Burada, memeli hücrelerinde RNA bağlayıcı proteinlerin (RRB) RNA hedeflerini belirlemek için FLAG-biotin tandem saflaştırma ile FbioCLIP-seq adı verilen değiştirilmiş bir CLIP-seq protokolü salıyoruz.

Flag-Biotin Tandem Arınma Aracılı Çapraz Bağlama ve İmmünopits Ile Protein-RNA Etkileşimlerinin Transkripsiyon-Geniş Profilleme

cDNA'nın kinetik çapraz bağlanması ve analizi, canlı hücrelerdeki protein-RNA etkileşimlerinin dinamiklerinin yüksek zamansal çözünürlükte araştırılmasını sağlayan bir yöntemdir. Burada protokol, maya hücrelerinin büyümesi, UV çapraz bağlama, hasat, protein saflaştırma ve yeni nesil dizileme kütüphanesi hazırlama adımları dahil olmak üzere ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

χCRAC Kullanarak Yüksek Zamansal Çözünürlükte Protein-RNA Etkileşim Dinamiğinin İn Vivo İzlenmesi

Burada, insan hücrelerinden toplam protein ekstraktını, biyotinile RNA ile kaplanmış streptavidin boncuklarını ve kütle spektrometri analizini kullanarak, spesifik RNA dizilerinin protein interaktörlerini ortaya çıkarmak, ölçmek ve doğrulamak için optimize edilmiş bir in vitro yöntem sunuyoruz.

Kısa Biyotinile RNA Kullanan RNA Bağlayıcı Proteinlerin Optimize Edilmiş Kantitatif Aşağı Çekme Analizi

Öğrenin, fotoreaktif nükleozid analogları ve UV çapraz bağlama kullanarak RNA bağlayıcı proteinlerin transkriptom genelindeki bağlanma bölgelerini nasıl belirleyebilirsiniz. Bu yöntem, RNA tanıma elemanlarını ve bağlanma tercihlerini tanımlamaya yardımcı olur.

PAR-Klip - RNA Cilt Proteinler Transcriptome geniş Cilt Siteleri Belirlemek Amacıyla Bir Yöntem

Daha fazla video keşfet