A base de quitosana, Laser Activated adesiva Thin Film cirúrgica ", SurgiLux ': Preparação e demonstração

Bioengineering

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Summary

A fabricação de uma novela, filme flexível fino adesivo cirúrgico a partir de ingredientes aprovados pela FDA, a quitosana e indocianina verde é descrito. Bonding deste adesivo para tecido colagenoso através de um processo de activação com um simples de baixa potência de laser infra-vermelho é demonstrada.

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Foster, L. J., Karsten, E. A Chitosan Based, Laser Activated Thin Film Surgical Adhesive, 'SurgiLux': Preparation and Demonstration. J. Vis. Exp. (68), e3527, doi:10.3791/3527 (2012).

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Abstract

Suturas são uma tecnologia 4.000 anos de idade que continuam a "padrão-ouro" para o fechamento da ferida, em virtude de sua força de reparação (~ 100 kPa). No entanto, as suturas podem agir como um nidus para a infecção e, em muitos procedimentos não são capazes de efectuar a reparação de feridas, ou interferir com a regeneração do tecido funcional. Uma colas e adesivos cirúrgicos, tais como as baseadas em fibrina e cianoacrilatos, têm sido desenvolvidos como alternativas à sutura para a reparação de feridas. No entanto, os actuais adesivos comerciais também têm desvantagens significativas, que vão de transferência viral e priónica e uma falta de força de reparação como com as colas de fibrina, a toxicidade dos tecidos e falta de biocompatibilidade para os adesivos de cianoacrilato à base. Além disso, actualmente disponíveis adesivos cirúrgicos tendem a ser à base de gel e pode ter estendido tempos de cura que limitam a sua aplicação. 2 Da mesma forma, o uso de lasers UV para facilitar a reticulação de proteínas em mecanismos baseados ou albumina 'solders "pode ​​levar a danos no DNA durante a soldagem a laser de tecido (LTW) predispõe danos térmicos aos tecidos. 3 Apesar de suas desvantagens, adesivos e LTW ter capturado cerca de 30% do mercado de fechamento da ferida relatado para ser em excesso de EUA $ 5 bilhões por ano, uma prova significativa para a necessidade de uma tecnologia sem sutura 4.

Na busca de tecnologia sem sutura nós utilizamos quitosana como um biomaterial para o desenvolvimento de uma película flexível fina, laser activado adesivo cirúrgico denominado «SurgiLux '. Este bioadesivo novel utiliza uma combinação única de biomateriais e fotônica que são aprovados pela FDA e utilizado com sucesso numa variedade de aplicações biomédicas e produtos. SurgiLux supera todas as desvantagens associadas com suturas e correntes adesivos cirúrgicos (ver Tabela 1).

Nesta apresentação, relatamos o protocolo relativamente simples para a fabricação de SurgiLux e demonstrara sua activação laser e resistência da solda de tecidos. Filmes SurgiLux aderência do tecido colagenoso, sem modificação química, tais como a ligação cruzada e através de irradiação com um relativamente baixo consumo de energia laser (120 mW) de infravermelhos em vez de luz UV. Filmes de quitosana tem uma atração natural, mas fraco adesivo para colágeno (~ KPa 3), laser ativação da base de quitosana SurgiLux filmes enfatiza a força dessa adesão por meio de interações da cadeia de polímeros, como consequência da expansão térmica transiente. 5 Sem essa 'ativação' processo , filmes SurgiLux são facilmente removidos. 6-9 SurgiLux foi testado tanto in vitro como in vivo numa variedade de tecidos, tais como nervos, intestino dura-máter, e córnea. Em todos os casos, demonstraram boa biocompatibilidade e lesão térmica desprezável em consequência da irradiação. 6-10

Protocol

1. Preparação da Solução SurgiLux

  1. Prepara-se uma solução de 2% (v / v) de ácido acético utilizando água desionizada num copo de vidro limpo, utilizar uma câmara de fluxo laminar para evitar a contaminação.
  2. Pesar 0,02% (w / v) do cromóforo, verde de indocianina, ICG, em um tubo Eppendorf estéril, assegurar o tubo é envolvido em folha de prata para evitar qualquer penetração de luz.
  3. Usando uma pipeta descartável e limpa, transferir aproximadamente 1 ml de solução diluída de ácido acético, para o tubo para dissolver o corante, agitar e manter envolvido em folha.
  4. Transferir o ICG solubilizado no copo e adicionar 2% (w / v) de pó de quitosano antes da adição de um agitador magnético estéril.
  5. Cobrir a proveta com Parafilm seguida, enrole em folha de prata, antes de misturar o conteúdo a cerca de 125 rpm durante 72 horas à temperatura ambiente numa câmara de fluxo laminar.
  6. Transferir o conteúdo em tubos de centrífuga limpo e centrifugar a 15000 xg durante 15 min a 4 ° C para remover qualquer particulate importa.
  7. Transferir cuidadosamente a solução SurgiLux verde, num copo de vidro limpo, cobrir com Parafilm seguida, enrole em folha de prata, antes de guardar num frigorífico durante 12 h para aumentar a viscosidade da solução.

2. Fundição de SurgiLux Films

  1. Utilizando uma seringa estéril, dispensar 8 ml da solução SurgiLux frio num prato, limpo Petri de 95 mm de diâmetro, e incline suavemente a placa para assegurar uma cobertura completa da solução. Variando a razão entre o volume da solução a área de fundição permite o controlo da espessura da película, ver Figura 1.
  2. Remover quaisquer bolhas visíveis na solução usando a ponta de uma agulha estéril. Cubra o prato em folha de prata e coloque no frigorífico para remover qualquer resíduo micro-empresas bolhas.
  3. Após 20 min cuidadosamente remover a placa de Petri do frigorífico, em lugar de uma câmara de fluxo laminar, cobrir com folha de prata e deixar a solução a evaporar, durante 3 semanas.
  4. Após complete evaporação, a pontuação dos bordos exteriores da película SurgiLux verde claro na placa de Petri e suavemente "casca" da película afastado da superfície do prato.
  5. O filme SurgiLux deve ser flexível e facilmente manipulados sem rasgar ou quebrar.
  6. Armazenar os filmes SurgiLux circulares na placa de Petri, embrulhados em folha de prata sob condições secas até que esteja pronto para uso.

3. Ativação Laser de Filmes SurgiLux adesivas

  1. Para demonstrar o processo de activação de laser que vai usar um pedaço de tecido de bovino como bife cortado com um tamanho de 15 mm de largura e 20 mm de comprimento. Dissecar o tecido em linha recta, utilizando um número 10 da lâmina cirúrgica, para produzir duas tiras de 15 por 10 mm.
  2. Aproximar as duas peças de tecido, de modo que as suas extremidades se tocam, mas não se sobrepondo, e usando um cotonete de algodão ou de gaze, suavemente absorver qualquer excesso de líquido.
  3. Em seguida, corte um pedaço de filme SurgiLux 7 x 9 mm e coloque cuidadosamente as longitudinalmente cinema em todo o p bisectedIECE de tecido, em seguida, pressione suavemente com um cotonete seco.
  4. Filmes SurgiLux são activadas através de um diodo laser de infra-vermelhos para um nível de 120 mW. Como este é um laser de classe III-B, medidas de segurança apropriadas devem ser tomadas, incluindo o uso de óculos de segurança apropriados para todas as pessoas.
  5. Começando no canto, irradiar a SurgiLux com um laser de infravermelhos fixado a 120 mW e um tamanho de mancha de feixe de 1 mm de diâmetro. Passar o ponto de feixe ao longo do filme verde a uma taxa de cerca de 1 mm por segundo. Repetir o processo de irradiação mais duas vezes.

4. Força da Reparação

  1. Cuidadosamente fixar as extremidades do tecido em as pinças de um instrumento de teste de tracção. Estamos usando um sistema Instron Mini55 com uma célula de carga de 50 Newton. A carga máxima, a força de tracção, e de extensão na ruptura foram calculados utilizando software de computador Bluehill (EUA). Meio de, pelo menos, 10 amostras foram determinados (n = 10).
  2. Tome-se o 'folga'e em seguida separar os pedaços de tecido a uma velocidade de 1 mm por segundo, até que as duas peças de tecido unidas por a tira SurgiLux separada completamente.

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Representative Results

Centrifugação leva a uma solução verde transparente, o que aumenta a viscosidade após armazenamento a 4-6 ° C. Após repouso durante 3 semanas, a solução verde é convertido em um filme transparente verde SurgiLux cerca de 20 microns de espessura e, tal como demonstrado no vídeo, é facilmente flexível.

Após a irradiação com o laser, as ligações de película SurgiLux ao tecido. Isto pode ser observado nos bordos do filme, onde o tecido é exibida a contrair medida que o feixe de laser passa através da película (Figura 2). Nenhuma carbonização ou ablação do tecido e película deve ser observada. A força de ligação de SurgiLux ao tecido deve ser suficiente para levantar os pedaços de tecido seccionados, e quando a resistência à tracção é medida deve ser de aproximadamente 15 kPa durante o ensaio aqui relatados.

Tabela 1
Tabela 1. </ Strong> Comparação de propriedades de sistema SurgiLux proposta e fibrina disponível comercialmente e cianoacrilato adesivos cirúrgicos.

Figura 1
Figura 1 Ilustração esquemática da fabricação de cola de película fina e SurgiLux processo de ativação;.. Correspondente ao texto do protocolo Clique aqui para ver maior figura .

Figura 2
Figura 2 Foto (x20) que mostra a película fina SurgiLux após activação laser aderida ao tecido do intestino bovino e 'contratação' dentro da incisão do tecido (T A, T B:. Pedaços separados otecido f, I: incisão, S: SurgiLux filme).

Figura 3
Figura 3 gráfico apresentando forças de adesão de tecidos para vários adesivos:. Quitosana e filmes SurgiLux aplicados sobre o tecido, Tisseel (fibrina) e géis Histoacryl (cianoacrilato) aplicadas no tecido.

Figura 4
Figura 4 Scanning Electron micrografias (SEMS) que ilustram células aderidas a filmes; SurgiLux. Linhagens de células humanas (a) células olfativas ensheathing x1.5k [], (b) os fibroblastos estromais [x500], e (c) do músculo esquelético derivadas de células estaminais de satélite [x1.7k]. Clique aqui para ver maior figura .


Figura 5. Gráfico mostrando a variação na espessura da película com o aumento do volume de solução de moldagem SurgiLux (ml) e uma área de fundição constante (7,09 x 10 3 mm 2).

Figura 6
Figura 6. Scanning Electron Micrograph (SEM) de película mostra a presença de "bicos" (SN) que sobressaem a partir da superfície (S).

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Discussion

A quitosana pode ser obtido de uma variedade de pesos moleculares e com vários graus de deactylation (ADD). As variações na pureza quitosana pode conduzir à presença de partículas na solução SurgiLux; centrifugação é usada para eliminar estes e deve resultar em uma solução transparente verde. No entanto, a filtragem pode também ser utilizado como um passo de fabricação adicional ou alternativo. Como com qualquer material de processamento, as variações, tais como quitosana DDA e peso molecular, tem implicações para os fisico, as propriedades biológicas e materiais das películas SurgiLux resultantes, incluindo a força da sua ligação ao tecido.

O processo de fabricação para SurgiLux permite variações consideráveis. Por exemplo, as alterações na razão entre o volume da solução a superfície de fundição (ml: 2 mm) podem ser utilizados para ajustar a espessura da película A Figura 5 mostra um aumento linear da espessura dos filmes finais SurgiLux como o volume.de solução vertida para a placa de Petri foi aumentada. Do mesmo modo, as modificações da superfície de vazamento pode ser usado para modificar a morfologia da película da superfície. Figura 6 mostra a presença de micro-empresas 'bicos' sobre a superfície da película SurgiLux. Tais técnicas de molde pode ser utilizado para a produção de várias superfícies para melhorar a aderência dos tecidos, impedem a ligação de células microbianas e promover a reintegração dos tecidos. 11 Além disso, vários agentes biologicamente activos podem ser incorporados no processo de fabricação para a produção de uma película de adesivo para a entrega da droga regionais 10.

A Tabela 1 resume as vantagens deste sistema adesivo de película fina em comparação com SurgiLux fibrina convencional e adesivos de cianoacrilato. Enquanto a força da reparação de tecidos é menor do que as suturas, SurgiLux evita as desvantagens desta técnica numerosas tradicional de fecho de feridas, bem como as correntes comerciais favorecidos adesivos cirúrgicos.

A capacidade de ligação para SurgiLux vários tecidos colagenosos, combinadas com a sua flexibilidade de material sugerem o seu potencial na laparoscopia, enquanto a versatilidade do processo de fabricação promove o seu desenvolvimento para aplicações em engenharia de tecidos e medicina regenerativa.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgements

Os autores reconhecem uma concessão do National Health and Medical Research Council da Austrália (NHMRC # 1000674) para LJR Foster.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chitosan Sigma-Aldrich 448877
Indocyanine Green Sigma-Aldrich I2633 Also known as Cardiogreen
Acetic acid Sigma-Aldrich 320099
Infra-red diode laser with fiber delivery. (808 nm, 120 mW, Beam core 200 μm) CNI Lasers Fc-808 Variable system up to 5 W power
Laser safety glasses CNI Lasers LS-G
Tensile testing apparatus Instron Pty Ltd 5542 50 N load cell

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References

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