Medición de la esperanza de vida en

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Biology

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Summary

Drosophila melanogaster es un organismo modelo eficaz para explorar las bases moleculares de la regulación de la longevidad. Este protocolo se discutirán los pasos involucrados en la generación de un reproducible, basado en la población de medición de la longevidad, así como los posibles escollos y cómo evitarlos.

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Linford, N. J., Bilgir, C., Ro, J., Pletcher, S. D. Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (71), e50068, doi:10.3791/50068 (2013).

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Abstract

El envejecimiento es un fenómeno que provoca deterioro constante fisiológica en casi todos los organismos en los que se ha examinado, que conducen a una disminución del rendimiento físico y un mayor riesgo de enfermedad. Envejecimiento individual se manifiesta a nivel de población como un aumento en la mortalidad dependiente de la edad, que a menudo se mide en el laboratorio mediante la observación de la vida útil en grandes cohortes de individuos de igual edad. Los experimentos que buscan cuantificar el grado en que las manipulaciones genéticas o ambientales impacto esperanza de vida en organismos modelo simples han tenido un éxito notable para la comprensión de los aspectos del envejecimiento que se conservan a través de taxones y para inspirar nuevas estrategias para extender la esperanza de vida y la prevención de la enfermedad asociada a la edad en mamíferos .

La mosca del vinagre, Drosophila melanogaster, es un organismo modelo atractivo para el estudio de los mecanismos del envejecimiento debido a su relativamente corta vida, la cría conveniente, y la genética fáciles.Sin embargo, las medidas demográficas del envejecimiento, incluyendo la edad y la supervivencia específica de la mortalidad, son extraordinariamente sensibles a incluso pequeñas variaciones en el diseño experimental y el medio ambiente, y el mantenimiento de las prácticas de laboratorio estrictos para la duración de los experimentos de envejecimiento se requiere. Estas consideraciones, junto con la necesidad de practicar un cuidadoso control de los antecedentes genéticos, son esenciales para la generación de mediciones robustas. De hecho, hay muchas controversias notables que rodean inferencia a partir de experimentos de longevidad en la levadura, gusanos, moscas y ratones que han sido relacionados con artefactos ambientales o genéticos 1-4. En este protocolo se describe un conjunto de procedimientos que se han optimizado durante muchos años de la medición de la longevidad en Drosophila utilizando frascos de laboratorio. También se describe el uso del software dLife, que fue desarrollado por nuestro laboratorio y está disponible para descarga ( http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab / software). dLife acelera el rendimiento y promueve las buenas prácticas mediante la incorporación de diseño experimental óptima, lo que simplifica el manejo mosca y recopilación de datos, análisis de datos y la normalización. También vamos a discutir los muchos escollos potenciales en el diseño, la recogida e interpretación de datos de vida útil, y proporcionar medidas para evitar estos peligros.

Protocol

Se recomienda almacenar alimentos experimentales, la pasta de levadura, y placas de agar de uva que aparecen en el protocolo a 4 º C y su uso dentro de 1-2 meses, siempre y cuando el molde y la sequedad no han fijado pulg condiciones ambientales estándar, tanto para el larvas y adultos escenificar implican el mantenimiento de moscas en una incubadora a 25 ° C con un ciclo de luz de 12:12 h de obscuridad y 60% de humedad relativa.

1. Preparación de Alimentos Experimental

  1. Para el crecimiento larval, se utiliza una versión modificada Caltech Medio 5, que se abrevia en este protocolo como CT.
  2. Se recomienda una dieta para adultos de Drosophila (SY) que se compone de azúcar (sacarosa) y levadura (levadura de cerveza liofilizado entera) en una base de agar 2%, que se ha hervido, suplementado con antibióticos y agentes anti-hongos, y distribuido (10 ml por vial) 6. Los alimentos deben ser deja solidificar y se evapora para 12-24 horas antes del almacenamiento. Debido a que el entorno de nutrientes puede Sustanciacialmente longevidad impacto, la coherencia en los procesos de cocción es esencial, tanto dentro de un experimento y para la comparación entre los experimentos.
  3. Si un agente farmacológico que se añaden a los alimentos para adultos, este fármaco puede ser mezclado en una pequeña cantidad de comida y en capas (2 ml) sobre la superficie de los alimentos, con los viales de control que recibían las capas que contienen vehículo solo.

2. Preparación de una pasta de levadura vivas

Combinar 5-6 ml de agua con 3 g de levadura seca activa y mezclar bien. La consistencia de la pasta de levadura debe ser la de una mantequilla de cacahuete lisa.

3. Preparación de una placa de agar de uva

  1. Añadir un paquete de una premezcla de uva agar en 500 ml de agua destilada en un matraz de 1.000 ml y seguir las instrucciones en el paquete para disolver la mezcla de agar de uva.
  2. Vierta cuidadosamente una capa gruesa de la mezcla en 100 mm placas de Petri mientras que evita la formación de burbujas. Un paquete de premezcla produce aproximadamente 14 grape placas de agar.
  3. Que los medios de comunicación enfriar y solidificar a temperatura ambiente con tapas en los de 15 min. Las placas pueden mantenerse a 4 ° C, envuelto en una envoltura de plástico, o se utiliza inmediatamente.

4. Colección de huevos sincronizados

Todos los medios utilizados en este protocolo, la levadura es decir, las placas de agar de uva, CT y 10% de alimentos SY, deben estar a temperatura ambiente.

  1. Extender una capa de 2-3 cm de diámetro de la levadura pega en una placa de agar uva y reservar.
  2. Coloque un huevo jaula amplia colección en una plataforma de CO 2 con la malla hacia abajo para anestesiar a las moscas. A base de nitrógeno anestesia es una alternativa a CO 2, utilizado por algunos laboratorios, que puede producir resultados de alta calidad 7.
  3. Usando un embudo, transferir 150-200 pares de moscas en la jaula de recolección de huevos.
  4. Colocar la placa de agar de uva para cubrir el extremo abierto de la jaula y asegurar con una tapa de extremo.
  5. Coloque la jaula de su lado hasta que las moscas despertar.A continuación, mantenga la caja, lado uva placa de agar hacia abajo, en la incubadora durante la noche.
  6. En el día siguiente, intercambiar la placa de uva con una placa de uva recién yeasted. Sólo coloque alrededor de 1 cm de diámetro de pasta de levadura en la superficie de la placa. Deseche el 1er día placa uva.
  7. Permita que los embriones a acumularse en la superficie de la placa de agar uva por 16-22 h. Una vez hecho esto, recoge la placa de agar uva y deseche las moscas de los padres.
  8. Lavar la superficie de las placas de agar de uva con 1x Tampón fosfato salino (PBS). Los huevos pueden ser movilizados, raspando suavemente con un hisopo de algodón. Tenga cuidado de no rayar, dañar o raspar las piezas delgadas de agar de la superficie de la placa. Con la ayuda de un embudo, vierta los huevos lavados en un tubo cónico de 15 ml.
  9. Deje que los huevos se depositan en el fondo del tubo y retirar el sobrenadante, teniendo cuidado de no perder ningún huevo. El volumen restante debe ser alrededor de 2-3 ml.
  10. Añadir 8-10 ml de PBS al tubo y repetir el paso por encima de 2-3 morveces e de lavar bien los huevos hasta que el sobrenadante es claro. Deshacerse de la levadura residual es la clave en este paso.
  11. Después del lavado, drenar todo el sobrenadante hasta que el volumen restante es 2 ml. Alícuota 32 l de huevos en botellas de TC con una punta de pipeta de grueso calibre. Huevos en la punta de la pipeta debe ser compacto, con poco o ningún líquido aspirado. Esto puede lograrse mediante la inserción de la punta de la pipeta profundamente en la solución de huevo y soltando rápidamente el émbolo para aspirar.
  12. Lugar cabeza de serie CT botellas de nuevo en la incubadora durante todo el desarrollo mosca.

5. Colección de la Edad de concordancia moscas adultas

  1. Los adultos generalmente se ECierre desde el día 9 en adelante. Deseche las moscas que surgieron en el primer día y colocar las botellas de nuevo en la noche a la mañana incubadora. Esta práctica evitará la selección inadvertida para los primeros emergentes y permiten la recolección de un número máximo de moscas sincronizados.
  2. 16-22 horas más tarde, traslado al adulto días de edad moscas into 10% SY botellas de alimentos. Si es necesario, otro lote se puede recoger el día siguiente.
  3. Volver vuela de nuevo en la incubadora y permitir que las moscas en alcanzar la madurez sexual y se aparean durante dos días. Registre el día de la transferencia a 10% botellas SY como el primer día de la edad adulta.

6. Clasificación moscas y configuración Experimento Longevidad

  1. Anestesie pequeños grupos de moscas en la almohadilla anestésico, entonces los machos y las hembras de clasificación en dos grupos utilizando un pincel. Si se utiliza CO 2, es crítico para minimizar la exposición para prevenir posibles duraderos problemas de salud que pueden comprometer la integridad de la longevidad experimento.
  2. Coloque 30 moscas del mismo sexo en viales individuales. Suponiendo que no hay cromosomas equilibradores de la población y de la progenie saludable, cada botella debe producir alrededor de 3-4 viales de cada sexo. Moscas alícuotas en viales individuales deben tener no más de 3-4 min, de modo que, en total, moscas sólo están expuestos a la anestesia durante un máximo de9-10 min.
  3. Repita los pasos 6.1-6.2 hasta que haya vial 8-10 repeticiones para cada género y el tratamiento experimental.

7. Configuración de la hoja de cálculo Excel para realizar el seguimiento del experimento Longevidad

  1. Recomendamos aleatorizar posición vial en lugar de viales de Agrupación por condición experimental con el fin de evitar el sesgo asociado con la ubicación vial en la incubadora y para ocultar la identidad del vial en el experimentador. Para ello, primero asigne un ID aleatorio numérico a cada frasco en un programa de hoja de cálculo, a continuación, organizar los viales en bandejas por número de ID. Si está utilizando el software de gestión de dLife experimento, siga el tutorial de configuración del experimento para generar el número de identificación para cada vial.
  2. (Opcional) Si utiliza un lector de código de barras o lector RFID en asociación con dLife, adjuntar una etiqueta RFID o códigos de barras a cada vial y asociar la etiqueta con el identificador numérico del vial en dLife. El programa reconocerá cada vial cuando se escanea con un lectory una guía para grabar los datos en la ubicación correcta en una hoja de cálculo. Uso de un lector de etiquetas, en relación con dLife reduce significativamente el tiempo de recogida de datos y el error de grabación.

8. Mantener el Experimento Longevidad

Los viales que contienen los alimentos frescos deben estar a temperatura ambiente para cada transferencia.

  1. Durante el período experimental, las moscas de transferencia sobre nuevos viales que contienen los alimentos frescos cada 2 días (mujeres jóvenes), o 3 veces a la semana (masculino o el femenino> 3 semanas de edad). Este paso se asegurará de que el entorno de la alimentación para las hembras jóvenes no se vea perturbado por la presencia de larvas. Esta transferencia debe realizarse sin anestesia, que puede inducir la mortalidad aguda, particularmente en los mayores moscas (Pletcher, observaciones personales).
  2. Durante cada vial de transferencia, registrar la edad, recuento de las moscas muertas en el vial de edad, y las moscas muertas que se llevan al vial de nuevo. Registre esta información por separado endos columnas en una hoja de cálculo (ya sea dLife o su propia hoja de cálculo). Esto asegurará que las moscas no son llevadas en cuenta dos veces. El número total de muertos (muertos + arrastrados) debe por lo menos igual al número de moscas realizadas a partir de la transferencia anterior. Reste el número de moscas previamente realizadas a partir del número total de muertes para determinar el número de nuevas muertes.
  3. Una mosca se considera de derecha censurado si dejaba en el experimento antes de la muerte natural a través de fuga o muerte accidental. Los animales que salen del experimento de esta manera debería ser introducido en una columna separada en el día en que la marcha salió del experimento. Moscas censurado no se registran como muerto (ver más abajo).
  4. Continúe repitiendo los pasos 8.1-8.2 hasta el último sobreviviente está muerto. Tenga en cuenta que a medida que la edad de las moscas, unas moscas pueden mentir sobre su espalda y aparecen muertos debido a su inactiveness. Por lo tanto, cuando se cuentan las moscas realizadas (muerto), toque en el lado de los viales para determinar si hay movimientos de las piernas. Si es así, thesmoscas correos están todavía vivos. En el caso en que las moscas quedan adheridas a la comida en el frasco viejo, pero vivos, no deberían ser contados como muertos y debe ser rescatado por más tapping del vial para desalojar la marcha. Censurar las moscas deben utilizarse con precaución, ya que puede dar lugar a sesgo experimental.

9. Análisis de Datos

  1. La curva de supervivencia muestra la probabilidad de que un individuo sobreviva para una edad dada y se calcula típicamente usando un enfoque de Kaplan-Meier (Figura 1) 8. En ausencia de datos de la derecha censurados, la fórmula se puede simplificar de tal manera que la supervivencia específica de la edad a la edad x (S x) se determina dividiendo el número de individuos vivos en el inicio de un tiempo de censo a la edad x (N x) por el número total de moscas en el experimento (N 0); x S = N x N / 0. 9.2) curvas de supervivencia son la forma más común de presentación de datos, y sepuede ser probado por la igualdad entre los grupos utilizando una prueba de log-rank. Inferencia razonable puede sacar de tan sólo 50 a 100 individuos de una cohorte. Supervivencia es una medida acumulativa, sin embargo, y por lo tanto las muertes que no están relacionadas con el envejecimiento, tales como los primeros años de vida, deprimirá la supervivencia a lo largo de la vida útil por lo que es difícil determinar los efectos específicos de envejecimiento.
  2. Un método de visualización de datos es la segunda función de mortalidad específica por edad, que muestra el riesgo de morir por cada intervalo de edad y presenta una descripción más matizada de 9,10 datos de supervivencia. Medidas de mortalidad son independientes de una edad a otra, y la forma de la curva de mortalidad es útil para la inferencia sobre la dinámica de envejecimiento, particularmente cuando los tratamientos se ajustan durante la vida adulta. Las estimaciones de la mortalidad específica por edad, sin embargo, carecen de precisión y exactitud con tamaños de muestra pequeños, y con frecuencia requieren varios a varios centenares de individuos por cohorte para una es fiabletimate 11.
  3. Otros métodos para la estimación de las diferencias de longevidad incluyen paramétrico (por ejemplo Gompertz) y semi-modelos paramétricos (por ejemplo, regresión de Cox). Estos modelos pueden ser de gran alcance, pero debe aplicarse con cautela debido a los supuestos acerca de la forma de las curvas de mortalidad y la naturaleza de los efectos del tratamiento, que podría llevar a la inferencia incorrecta 11,12.

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Representative Results

Un esquema simplificado del protocolo se presentan en la Figura 1, donde se describen los pasos clave. La parte de sincronización del protocolo se puede utilizar para diversos ensayos que requieren emparejados por edad moscas adultas.

Las curvas típicas de supervivencia de moscas de tipo silvestre se muestran en la Figura 2a, utilizando el experimento dLife software de gestión (Figura 2b, c). Los machos adultos suelen vivir más corto, con las dos poblaciones de alcanzar una longevidad media y la mediana de> 50 días en un 10% de los alimentos SY a 25 ° C. Tenga en cuenta que la supervivencia sigue siendo alta en la primera parte del experimento y luego disminuye de manera exponencial.

Drosophila esperanza de vida se ve afectada por las condiciones ambientales, como la temperatura y la dieta. Figura 3a muestra que los machos adultos suelen vivir sensiblemente menor medida que la temperatura aumenta. Del mismo modo, el efecto de la dieta en la vida útil se presenta en la Figura 3b

La densidad de las cohortes durante el desarrollo puede influir adulto esperanza de vida y alterar el tiempo de desarrollo. Aquí se muestra un ejemplo de cómo diferentes densidades de huevos sincronizados afectar el desarrollo larval. Como se muestra en la Figura 4, el rendimiento de las moscas adultas es pobre y la superficie de los alimentos es susceptible de secado cuando el número de huevos es demasiado bajo. En el otro extremo del espectro, el desarrollo de las larvas se retarda en botellas de hacinamiento, y el rendimiento de las moscas adultas se reduce.

La curva de supervivencia de la cohorte como un todo puede ser influenciado de manera significativa por los efectos anómalos vial, como se muestra en la Figura 5. Datos irregulares de supervivencia de los viales individuales pueden tener varias causas, como la calidad de los alimentos pobres o bacteriana / micótica acumulación y la infección. Mientras que tales muertes anómalas cun sesgar la medida de la supervivencia de la población, no hay una métrica directa para determinar adecuadamente que un vial debe ser excluido del experimento. Estas situaciones, por lo tanto es mejor evitar por buenas prácticas de manipulación y mitigados mediante el uso de un tamaño de muestra grande.

La Figura 6 muestra ejemplos de condiciones viales que pueden conducir a muertes anómalos. En general, cualquier condición que puede conducir a pequeñas grietas donde las moscas pueden quedar atrapados y morir debe ser evitado. Los ejemplos incluyen: las burbujas en la comida, sequedad en la comida que conduce a la disminución de distancia de la pared del frasco, y el agrietamiento en los alimentos se muestran en la Figura 5a (un ejemplo suave con una sola burbuja), la figura 5b, y 5c Figura, respectivamente . Alimentos excesivamente seco, como se muestra en la figura 5b y 5c Figura debe ser cuidadosamente volteado durante las transferencias, ya que la comida se pueden desprender y caer sobre las moscas en la new vial. El crecimiento de bacterias en la superficie de los alimentos puede conducir a la infección o atrapamiento físico y por lo tanto puede aumentar la mortalidad. Algunas bacterias en la superficie de la comida aparece transparente y brillante como si no la transpiración de la comida (no mostrado), mientras que otros tipos de bacterias se manifestará como colonias blancas (Figura 5d). Viales que presenten alguna de estas condiciones deben tenerse en cuenta y además cuenta cuando se interpretan los datos. En general, hacemos hincapié en que la atención cuidadosa a la cría tanto en las etapas de larva y adulto puede soportar la longevidad y la salud de las moscas adultas y reducir la aparición de problemas que conducen a causas ambiguas de muerte en la edad adulta.

Figura 1
Figura 1. Esquema simplificado de un ensayo de Drosophila vida útil.

"Figura Figura 2. (A) curvas representativas duración de vida de las mujeres de control w 1118 (círculos) y adulto de sexo masculino (cuadrados) vuela a 25 ° C en un alimento SY10%. (B, C) disparos representativos de pantalla del software dLife.

Figura 3
Figura 3. Efectos de la temperatura (A) y la dieta (B) en el adulto vida útil. A. Adulto control (Canton S) moscas macho se mantuvieron hasta la edad adulta a 18 ° C, 25 ° C, o 29 ° CB de control de adultos (w 1118) moscas hembras fueron expuestas a un 15% o 5% SY SY dieta.

Figura 4
Figura 4. Día 9 de desarrollo (a 25 ° C) de huevos sincronizados, alícuotas en frascos de alimentos CT. Volumen de la alícuota de embrión que contiene es como se muestra debajo de cada botella.

Figura 5
Figura 5. Complot Representante del software dLife que muestra la supervivencia por vial. La flecha indica un vial único anómalo dentro de un grupo.

La figura 6
Figura 6. Ejemplos de calidad de los alimentos subóptima. A. burbujas en la superficie de los alimentos. Comida B. encogido lejos del borde del vial. C. Grietas en el alimento. Las bacterias D. acumulación en la superficie de los alimentos.

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Discussion

El protocolo presentado aquí describe un método para producir mediciones reproducibles de la longevidad de adultos de Drosophila que es adaptable para la evaluación de las intervenciones genéticas, farmacológicos, y ambientales. Aspectos cruciales del protocolo incluyen el control cuidadoso del entorno de desarrollo larval, reduciendo al mínimo el estrés adulto, y minimizar el sesgo entre los grupos experimentales y controles. También presentamos el uso del software de gestión de ciclo de vida dLife experimento. Con sólo conectar un código de barras o etiquetas RFID a cada vial, el programa dLife ayudará en la adquisición de datos para cada medida y en el trazado de la curva de supervivencia. Aunque actualmente es la más adecuada para los estudios de la mosca de vida útil utilizando viales, esta herramienta de gestión experimento podría ser fácilmente adaptado para su uso en otros organismos, con diferentes tipos de cámaras de población, o para medidas adicionales de supervivencia, incluyendo la resistencia al estrés y la toxicidad del fármaco.

Pntes de comenzar cualquier evaluación de la longevidad, primero hay que controlar cuidadosamente la producción de las poblaciones parentales. La variabilidad genética es un factor importante, como es la salud de las cepas parentales. Estos factores han llevado a una considerable controversia pública asociada con los primeros estudios que informaron los reguladores putativo longevidad 13. El investigador tiene varias opciones para minimizar los efectos atribuibles a la variabilidad en los antecedentes genéticos. Para la manipulación genética, todas las cepas genéticamente alteradas deben ser controlados a través de fondo-ya sea retrocruzamiento con una cepa de control (por lo menos 6 veces), o usando sistemas inducibles (por ejemplo, alelos sensibles a la temperatura o fármaco-inducible la expresión del transgen). El GeneSwitch y Tet-en los sistemas de 14,15 son populares y permitir la comparación directa de las moscas con el mismo fondo genético en el que es o el transgén inducida o provocada no. Para todos los sistemas inducibles, adecuados controles contemporáneos están obligados a evitar confounds asociado con el inductor. La falta de control para el fondo genético casi siempre resulta en vigor híbrido, que se puede extender la vida útil en la generación F1 de un cruce entre dos cepas diferentes por razones no relacionadas con la manipulación destinado 13. Este factor es de particular preocupación cuando se utiliza el sistema GAL4-UAS. Para las intervenciones ambientales (por ejemplo, tratamiento con fármacos, dieta, temperatura, etc), es aconsejable para estudiar los efectos de la intervención en más de una cepa. Finalmente, ambos de 16 años de edad y el estrés parental 17 puede influir en la longevidad de la generación F1, y por esta razón, los adultos jóvenes sanos debe ser elegido para la producción de huevos.

Algunos aspectos importantes del control del medio ambiente larva / pupa incluyen la prevención del hacinamiento y el mantenimiento de un ambiente controlado con una estricta regulación de los períodos de luz y oscuridad, la humedad y la temperatura. Estos factores afectan tanto al momento de devDESARROLLODELACAPACID ADDEEVALUACI y la calidad física de los adultos resultantes. Adversos entornos de larvas, tales como alta densidad de las larvas, puede conducir a la activación de factores inducibles por estrés (por ejemplo, choque térmico expresión de la proteína) que se sabe que influyen en la longevidad de adultos 18.

Durante la fase adulta, la atención cuidadosa con el medio ambiente sigue siendo esencial. La elección de la dieta sola puede influir enormemente en la vida útil y puede interactuar con factores genéticos para producir específicos dieta efectos sobre la longevidad. Por otra parte, algunas de las alternativas de alimentos comunes de bases (extracto de levadura en lugar de la levadura de cerveza liofilizada entera) puede acortar la vida útil drásticamente 19, dejando abierta la posibilidad de que la comida en sí está causando estrés organismal que puede afectar a la evaluación de la longevidad. En este artículo, hemos destacado las posibles fuentes de estrés en el entorno de la dieta incluyendo anomalías físicas en los alimentos (por ejemplo, burbujas, espuma, grietas, bacterias, etc) que pueden physically atrapar a los animales. Sustitución periódica de alimentos de edad con comida fresca (al menos tres veces a la semana) puede superar muchas de estas dificultades. Por otra parte, temperatura 20, humedad (observaciones personales), la iluminación 21, y la presencia de sus congéneres (ambiente social) 22 todo puede modular vida, y la atención al control de estos factores en el experimento es importante para evitar un sesgo en los resultados. Mientras que el número de moscas dentro de un vial disminuye con el tiempo, se ha encontrado que el uso de anestesia para ajustar el número de moscas puede incrementar la mortalidad de una manera dependiente de la edad (Pletcher, observaciones personales), y no recomienda este procedimiento. La posición precisa de los viales en un incubador es también un factor, incluso en un entorno aparentemente controlada. Distribución aleatoria física de los grupos experimentales con controles pueden mitigar el sesgo asociado con la colocación vial y se requiere para la inferencia estadística adecuada. Incluso concondiciones cuidadosamente controladas, pequeñas diferencias se pueden observar entre los experimentos y el uso de los controles en-experimento es esencial.

Enfoques alternativos de alimentación se han propuesto para el análisis de tiempo de vida incluyendo un enfoque alimentador capilar (método CAFE) 23. Este método es especialmente en la capacidad de proporcionar mediciones precisas de consumo de alimentos, pero el resultado es notablemente corta duración moscas 24. Tensiones potenciales asociados con el ambiente de alimentación deben ser considerados al evaluar la relación combinada entre la dieta y los factores genéticos de la longevidad en general.

El análisis demográfico, incluyendo el cálculo de la supervivencia y las curvas de mortalidad pueden revelar mucha información sobre la dinámica de la población que envejece. Una típica curva de supervivencia se mantendrá relativamente estable durante un largo periodo temprano en la vida y aumentar su tasa de disminución en las edades más avanzadas, lo que corresponde a un período de f baja mortalidadollowed por un período de un aumento exponencial de la mortalidad. Un ambiente estresante por lo general se manifiesta como un exceso de muertes prematuras en la población y un baño anómala en la curva de supervivencia. Aunque tal resultado puede indicar diferencias significativas entre los tratamientos, normalmente no será robusto para la replicación. Por ello, recomendamos al menos dos independientes (es decir, no contemporáneas) replicar los experimentos se ejecutará antes de cualquier conclusión firme se dibujan. Puede ser que el esfuerzo adicional hacia el aumento de tamaño de la muestra, el control de las condiciones de cría, y la mejora de la salud de las poblaciones de los padres es necesario.

Haga censura (eliminación de los animales del experimento que se escapan o se presume muerto por causas accidentales) de los animales que mueren debido a condiciones ambientales estresantes se debe aplicar con precaución extrema. En sentido estricto, la censura debe ocurrir al azar a través de tratamientos experimentales, y si el experimental interventien la sensibilidad al estrés modula, uno sin darse cuenta puede aplicar un tratamiento a nivel de selección a la población. Como regla general, evitando la presencia de factores que pueden producir la muerte temprana ambigua (principalmente asociada con la fuente de alimento) es mejor que la censura, y censurar sólo se debe aplicar a los organismos que se observaron a morir o escaparse durante la manipulación física.

Una consideración final es la evaluación de la significación estadística. Mientras que las grandes tamaños de muestra de cohorte proporcionar potencia impresionante para distinguir pequeñas diferencias entre los tratamientos, la potencial importancia biológica de esta diferencia también deben ser considerados. Con los experimentos longevidad de tamaño razonable, las diferencias tan bajas como 1.2% a menudo son estadísticamente muy significativa, pero el impacto global de la intervención sobre el estado de salud puede ser menor. Por lo tanto, tanto la significación estadística y biológica debe ser considerado cuando se interpretan los resultados globales del experimento. Inferencia sobre el proceso de envejecimiento de los experimentos de supervivencia puede ser aumentado por las medidas relacionadas con la edad de la disminución de las medidas de salud conductuales o fisiológicas, incluyendo la capacidad de escalar 25 y gastrointestinal integridad de la pared 7.

En resumen, el organismo modelo Drosophila una atractiva opción para estudiar los mecanismos de envejecimiento. Con una técnica experimental cuidadosa, el análisis demográfico sólido puede proporcionar información sobre el impacto de los factores farmacológicos y genéticos en el proceso de envejecimiento.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por fondos de la Fundación Médica Ellison (SDP, http://www.ellisonfoundation.org/index.jsp ), NIH K01AG031917 (NJL, http://www.nih.gov/ ), NIH 5T32GM007315-35 (JR) y NIH R01AG030593 (SDP). En este trabajo se utilizan los recursos del núcleo Drosophila Envejecimiento (DAC) del Centro de Excelencia de choque Nathan en la biología del envejecimiento financiado por el Instituto Nacional del Envejecimiento P30-AG-013283 ( http://www.nih.gov/ ). Los autores desean agradecer al Laboratorio Pletcher útil para los debates y, en particular Brian Chung para la lectura crítica del manuscrito. Nos gustaría reconocer Nick Asher y Borowicz Kathryn para asistencia para la recopilación de datos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Active Dry Yeast Fleishmann’s Yeast 2192
Grape Agar Powder Premix Genesee Scientific 47-102
Large Embryo Collection Cages Genesee Scientific 59-101
Large Replacement End Caps Genesee Scientific 59-103
6 oz Square Bottom Bottles, polypropylene Genesee Scientific 32-130
Flugs Closures for Stock Bottles Genesee Scientific 49-100
Drosophila Vials, Wide, Polystrene Genesee Scientific 32-117
Flugs Closures for Wide Vials Genesee Scientific 49-101
Wide Orifice Aardvark Pipet Tips, 200 ul Denville Scientific P1105-CP
Flystuff Flypad, Standard Size Genesee Scientific 59-114
BD Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-70C
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lids, Raised Ridge; 100 O.D. x 15 mm H; Fisher Scientific 08-757-12
Kimax* Colorware Flasks 1,000 ml yellow Fisher Scientific 10-200-47
PBS pH 7.4 10x Invitrogen 70011044
Gelidium Agar Mooragar n/a
Brewer's Yeast MP Biomedicals 0290331280
Granulated Sugar Kroger n/a
Tegosept Genesee Scientific 20-266 Fly Food Preservative
Propionic Acid, 99% Acros Organics 149300025 Fly Food Preservative
Kanamycin Sulfate ISC BioExpress 0408-10G
Tetracycline HCl VWR 80058-724

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Toivonen, J. M., et al. No influence of Indy on lifespan in Drosophila after correction for genetic and cytoplasmic background effects. PLoS Genet. 3, e95 (2007).
  2. Spencer, C. C., Howell, C. E., Wright, A. R., Promislow, D. E. Testing an 'aging gene' in long-lived drosophila strains: increased longevity depends on sex and genetic background. Aging Cell. 2, 123-130 (2003).
  3. Burnett, C., et al. Absence of effects of Sir2 overexpression on lifespan in C. elegans and Drosophila. Nature. 477, 482-485 (2011).
  4. Bokov, A. F., et al. Does reduced IGF-1R signaling in Igf1r+/- mice alter aging? PLoS One. 6, e26891 (2011).
  5. Lewis, E. B. A new standard food medium. Drosophila Information Service. 34, 117-118 (1960).
  6. Skorupa, D. A., Dervisefendic, A., Zwiener, J., Pletcher, S. D. Dietary composition specifies consumption, obesity, and lifespan in Drosophila melanogaster. Aging Cell. 7, 478-490 (2008).
  7. Rera, M., et al. Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog. Cell Metab. 14, 623-634 (2011).
  8. Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric Estimation from Incomplete Observations. Journal of the American Statistical Association. 53, 457-481 (1958).
  9. Pletcher, S. D. Mitigating the Tithonus Error: Genetic Analysis of Mortality Phenotypes. Sci. Aging Knowl. Environ. 2002, pe14 (2002).
  10. Pletcher, S. D., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Why do life spans differ? Partitioning mean longevity differences in terms of age-specific mortality parameters. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 55, 381-389 (2000).
  11. Promislow,, Tatar,, Pletcher,, Carey, Below-threshold mortality: implications for studies in evolution, ecology and demography. Journal of Evolutionary Biology. 12, 314-328 (1999).
  12. Pletcher, Model fitting and hypothesis testing for age-specific mortality data. Journal of Evolutionary Biology. 12, 430-439 (1999).
  13. Partridge, L., Gems, D. Benchmarks for ageing studies. Nature. 450, 165-167 (2007).
  14. Roman, G., Endo, K., Zong, L., Davis, R. L. P[Switch], a system for spatial and temporal control of gene expression in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 12602-12607 (2001).
  15. Ford, D., et al. Alteration of Drosophila life span using conditional, tissue-specific expression of transgenes triggered by doxycyline or RU486/Mifepristone. Exp. Gerontol. 42, 483-497 (2007).
  16. Priest, N. K., Mackowiak, B., Promislow, D. E. The role of parental age effects on the evolution of aging. Evolution. 56, 927-935 (2002).
  17. Smith, E. M., et al. Feeding Drosophila a biotin-deficient diet for multiple generations increases stress resistance and lifespan and alters gene expression and histone biotinylation patterns. J. Nutr. 137, 2006-2012 (2007).
  18. Sorensen, J. G., Loeschcke, V. Larval crowding in Drosophila melanogaster induces Hsp70 expression, and leads to increased adult longevity and adult thermal stress resistance. J. Insect Physiol. 47, 1301-1307 (2001).
  19. Bass, T. M., et al. Optimization of dietary restriction protocols in Drosophila. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 62, 1071-1081 (2007).
  20. Miquel, J., Lundgren, P. R., Bensch, K. G., Atlan, H. Effects of temperature on the life span, vitality and fine structure of Drosophila melanogaster. Mechanisms of Ageing and Development. 5, 347-370 (1976).
  21. Pittendrigh, C. S., Minis, D. H. Circadian systems: longevity as a function of circadian resonance in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69, 1537-1539 (1972).
  22. Joshi, A., Mueller, L. D. Adult crowding effects on longevity in Drosophila melanogaster: Increase in age-dependent mortality. Current Science. 72, 255-260 (1997).
  23. Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 8253-8256 (2007).
  24. Lee, K. P., et al. Lifespan and reproduction in Drosophila: New insights from nutritional geometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 2498-2503 (2008).
  25. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).

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5 Comments

  1. we need this video, please help me! thank you!

    Reply
    Posted by: Min Y.
    August 9, 2013 - 4:37 AM
  2. Hello Min, Please send an email to linford [at] umich.edu and we will be happy to reply with a copy of this video.

    Reply
    Posted by: Nancy L.
    August 9, 2013 - 5:19 PM
  3. Is the DLife software still available for download? I'm no longer seeing a link on your lab page. Thanks in advance!

    Reply
    Posted by: Rogan G.
    March 31, 2017 - 10:18 AM
  4. Hi Rogan, Thanks a lot for your interest-
    The DLife system is now commercialized by the developers through Flidea, LLC. Please contact me at info@flidea.tech for more info!

    Reply
    Posted by: Jenny R.
    March 31, 2017 - 3:07 PM
  5. Thank you!

    Reply
    Posted by: Rogan G.
    March 31, 2017 - 3:45 PM

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