Матрица-лазерной десорбцией / ионизацией Время полета (MALDI-TOF) масс-спектрометрический анализ интактных белков Больше, чем 100 кДа

Общая цель данной процедуры заключается в высокочувствительном анализе интактных белков с молекулярной массой более 100 килродальтон с помощью масс-спектрометрии MALDI. Для этого сначала подготавливают растворы матрикса. На втором этапе тонкий слой раствора наносят на мишень.

Затем образец и смесь матриц наносятся на мишень. Заключительным этапом является наблюдение за пятнами образцов под микроскопом. В конечном итоге для анализа интактных белков и регистрации масс-спектров используется масс-спектрометр.

Основным преимуществом масс-спектрометрии MALDI по сравнению с другими аналитическими подходами, такими как ионизация электрораспылением, является ее более высокая устойчивость к воздействию солей, загрязнений и детергентов. Еще одним преимуществом MALDI является то, что она генерирует ионы с меньшим количеством зарядов по сравнению с электрораспылением. Следовательно, получение и интерпретация данных MALDI довольно просты.

Для начала повторной кристаллизации налейте 10 milliliters 40%этанола в стакан Pyrex. Затем добавьте 600 milligrams матрицы, используя водяную баню и резистивный нагреватель. Нагрейте раствор матрицы и перемешивайте его до полного растворения матрицы.

Повторяйте предыдущие действия до полного насыщения раствора. Оставьте раствор медленно охлаждаться при комнатной температуре в течение нескольких часов, затем храните при температуре four degrees Celsius в течение ночи. Если кристаллы не образовались, осторожно поцарапайте внутреннюю стенку стакана чуть ниже поверхности раствора стеклянной палочкой, чтобы инициировать кристаллизацию.

Наконец, соберите кристаллы матрицы путем фильтрации. Промойте остатки кристаллов в колбе минимальным количеством ледяного растворителя и отфильтруйте их. После завершения фильтрации дайте кристаллам высохнуть, чтобы очистить мишень для MALDI.

Промойте его метанолом и аккуратно протрите салфеткой Kimwipe. Затем промойте водой и снова протрите салфеткой Kimwipe. Поместите мишень MALDI в стакан объемом 600 мл и залейте 50% этанолом.

Затем подвергните мишень воздействию ультразвука в растворе этанола в течение 10 минут в ультразвуковой бане. Если на пластине остались остатки, повторите предыдущие шаги. Промойте мишень метанолом или водой; используемый растворитель определяет степень растекания образца.

Затем наклоните мишень так, чтобы вся жидкость была собрана салфеткой Kim wipe. Высушите мишень потоком азота. На следующем этапе растворите alpha CHCA в ацетоне.

Для приготовления насыщенного раствора погрузите наконечник дозатора объемом 10 µL в насыщенный раствор α-CHCA так, чтобы в наконечник попало небольшое количество раствора. Быстрым касанием наконечника дозатора нанесите раствор α-CHCA на мишень MALDI, используя пластиковую пробирку объемом 1.5 mL. Приготовьте раствор α-CHCA с концентрацией 20 mg/mL, растворив α-CHCA в смеси ацетонитрила и 5% муравьиной кислоты в объемном соотношении 7:3; маркируйте полученный раствор как «раствор α-CHCA».

После этого приготовьте раствор DHB с концентрацией 20 mg/mL, растворив DHB в смеси ацетонитрила и 0,1% трифторуксусной кислоты в объемном соотношении 7:3; подпишите этот раствор как «раствор DHB». Смешайте раствор α-CHCA и раствор DHB в соотношении объемов 1:1. Перед началом данной процедуры в качестве дополнительного шага для получения раствора C-H-C-A-D-H-B можно очистить образцы белков путем смены буфера, как описано в указанной литературе.

В противном случае нанесите неочищенный образец белка на мишень MALDI. Затем нанесите 0,5 microliters образца белка на подготовленный тонкий слой alpha CHCA. Сразу после этого добавьте 0,5 microliters раствора C-H-C-A-D-H-B.

Нанесите 0,5 µL стандарта Cain на MALDI-пластину, затем добавьте 0,5 µL раствора матрицы. После высыхания образцов и стандарта Cain осмотрите пятна под микроскопом, установите мишень в прибор и выберите соответствующие настройки прибора. Затем выберите подходящий диапазон отношения массы к заряду.

Снимите спектры калибратора и откалибруйте прибор, используя соответствующую интенсивность лазера. Снимите спектры образцов белка. Здесь представлен анализ методом MALDI-TOF интактного участка хромосомы Maintenance one protein.

Смесь C-H-C-A-D-H-B обеспечила получение масс-спектров более высокого качества с точки зрения соотношения сигнал/шум и чувствительности. В частности, удалось обнаружить 0.5 пикомолей белка, нанесенного на мишень MALDI, тогда как то же количество белка было едва заметно при использовании синаповой кислоты. При использовании смеси C-H-C-A-D-H-B наблюдались многозарядные ионы белка, что позволило определить массу с более высокой точностью, поскольку в случае осевого прибора TOF разрешение пика обратно пропорционально отношению массы к заряду. Кроме того, при использовании смеси C-H-C-A-D-H-B предпочтительным методом нанесения матрицы стал метод тонкого слоя.

При использовании метода высушенной капли белки с массой более 100 киродальтон обнаружены не были. Мономерный белок бета-коллектин также был проанализирован с помощью мульти-TOF. Спектры C-H-C-A-D-H-B оказались более качественными, чем спектры с синиковой кислотой, с точки зрения чувствительности и разрешения.

Кроме того, наличие многозарядных ионов позволило с более высокой точностью подтвердить массу белка. Здесь представлен анализ интактного иммуноглобулина методом MALDI. Спектры, полученные с использованием смеси C-H-C-A-D-H-B, были значительно более интенсивными, чем спектры с SA и альфа-CHCA.

В частности, белковые сигналы были более интенсивными и имели лучшее разрешение в спектрах C-H-C-A-D-H-B. Использование смеси C-H-C-A-D-H-B и метода нанесения тонким слоем продемонстрировало значительное улучшение качества анализа крупных интактных белков. Масс-спектры были получены с помощью прибора MALDI-TOF.

В представленном протоколе показано, как получить масс-спектры высокого качества для белков с высокой молекулярной массой с помощью мульти-инструмента. При проведении данного типа анализа важны три момента. Во-первых, необходимо использовать свежеприготовленный раствор метрик.

Во-вторых, необходимо правильно нанести образец на мишень Mali. И в-третьих, использовать соответствующие настройки прибора, такие как интенсивность лазера.