Explorando o microbioma da raiz: extraindo dados da comunidade bacteriana do solo

O objetivo geral deste experimento é caracterizar três compartimentos do microbioma radicular, solo, rizosfera e endosfera radicular, usando o perfil da comunidade do gene do RNA ribossômico 16S. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em ecologia microbiana, como os fatores bióticos e abióticos que são os principais impulsionadores da estrutura do microbioma. A principal vantagem dessa técnica é que ela padroniza cada etapa, desde a separação da raiz e da rizosfera até a extração do DNA e a preparação de uma biblioteca de sequenciamento.

Demonstrando este procedimento estará Tuesday Simmons, um estudante de pós-graduação no Laboratório Coleman-Derr. Para iniciar o protocolo, colete amostras de solo a granel com um coletor de núcleo de solo esterilizado com etanol para obter solo livre de raízes de plantas. Colete um núcleo de aproximadamente 23 a 30 centímetros da base da planta.

Em seguida, transfira o solo para um saco plástico, homogeneize o solo sacudindo suavemente o saco, transfira uma alíquota de 600 miligramas da amostra de solo para um tubo de dois mililitros e coloque imediatamente o tubo de dois mililitros em gelo seco até a extração do DNA. Para coletar a raiz e a rizosfera, use uma pá esterilizada com etanol para desenterrar a planta, tomando cuidado para obter o máximo possível da raiz. Sacuda suavemente o excesso de solo das raízes até que haja aproximadamente dois milímetros de solo aderido à superfície da raiz.

Para plantas grandes, use uma tesoura estéril para cortar uma subseção representativa das raízes e coloque um mínimo de 500 miligramas de tecido radicular em um frasco cônico de 50 mililitros. Adicione tampão de remoção de epífita suficiente para cobrir as raízes e, em seguida, coloque imediatamente a amostra em gelo seco. Para separar a rizosfera das raízes, descongele a amostra de raiz no gelo e, em seguida, sonice as amostras de raiz.

Transfira as raízes para um tubo limpo e resfriado de 50 mililitros usando uma pinça estéril. Não descarte o tubo original com tampão e terra. Isso contém a fração da rizosfera.

Em seguida, centrifugue o tubo que contém o tampão e a rizosfera. Transvase o sobrenadante e coloque a fração da rizosfera em gelo seco. Para lavar as raízes, adicione aproximadamente 20 mililitros de água estéril de quatro graus Celsius à fração da raiz.

Lave a raiz agitando vigorosamente por 15 a 30 segundos e depois escorra a água. Use uma espátula estéril para transferir rapidamente 250 miligramas de solo e rizosfera para tubos de coleta separados fornecidos em um kit comercial de isolamento de DNA para extração de solo e, em seguida, prossiga usando o protocolo do fornecedor do kit. Após a eluição, armazene o DNA a menos 20 graus Celsius até que esteja pronto para prosseguir com a preparação da biblioteca de amplicon e, em seguida, extraia o DNA das amostras de raiz.

Resfrie um almofariz e pilão esterilizados usando nitrogênio líquido. Meça de 600 a 700 miligramas de tecido radicular e coloque o tecido na argamassa e adicione cuidadosamente nitrogênio líquido suficiente para cobrir as raízes. Moa as raízes em pedaços pequenos.

Continue o processo de adição de nitrogênio líquido e moagem pelo menos duas vezes, sendo consistente entre as amostras, até que as raízes fiquem com um pó fino. Rapidamente, antes que o pó da raiz comece a descongelar, use uma espátula estéril para transferir o pó da raiz para tubos pré-pesados de 1,5 mililitro no gelo. Registre o peso do tubo e do pó.

Use uma espátula estéril para transferir rapidamente 150 miligramas de pó de raiz para o tubo de coleta fornecido no kit comercial de isolamento de DNA projetado para extração do solo e, em seguida, prossiga com o isolamento de DNA usando o protocolo do fornecedor do kit. Preparar uma mistura principal de PCR suficiente para amplificar cada amostra de ADN em triplicado. Despeje a mistura principal em um reservatório de pipeta multicanal estéril de 25 mililitros e distribua 66 microlitros da mistura principal em cada poço de uma nova placa de PCR de 96 poços.

Em seguida, adicione seis microlitros de cinco nanogramas por microlitro de DNA da placa de DNA normalizada à placa de mistura principal. Em seguida, adicione à placa mestra 1,5 microlitros de primer direto de 10 micromolares, de modo que cada coluna tenha um código de barras de encaminhamento diferente, e 1,5 microlitros de primer reverso de 10 micromolares, de modo que cada linha tenha um código de barras reverso diferente. Cubra a placa com filme e gire a placa brevemente a 3.000 RCF.

Use uma pipeta multicanal para misturar suavemente o conteúdo, depois divida-os em três placas com 25 microlitros de mistura de reação e cubra as placas com filme de PCR. Amplificar o DNA em cada placa usando um termociclador. Após a amplificação, agrupe as três placas replicadas em uma única placa de 96 poços.

Usando uma planilha de computador, calcule o volume de 100 nanogramas de cada amostra, bem como o volume médio de todas as amostras. Para cada produto de PCR em branco, adicione o volume médio calculado em um único tubo de 1,5 mililitro. Para as amostras amplificadas com sucesso, agrupe 100 nanogramas de cada amostra no mesmo tubo, meça a concentração do produto combinado usando um fluorômetro de bancada e elua 600 nanogramas de DNA em água de grau molecular até um volume final de 100 microlitros em um tubo de 1,5 mililitro.

Armazene o restante do produto agrupado a menos 20 graus Celsius. Antes de purificar a alíquota de DNA de 600 nanogramas, prepare 600 microlitros de etanol fresco a 70%. Siga o processo de purificação por PCR estabelecido usando esferas paramagnéticas.

Agite o tubo de contas magnéticas para ressuspender as contas que se depositam no fundo. Adicione 1x volume, 100 microlitros, de solução de esferas à alíquota de 600 nanogramas de DNA. Misture bem a solução e as esferas pipetando 10 vezes.

Após uma mistura completa, incube a mistura por cinco minutos em temperatura ambiente. Coloque o tubo no suporte magnético por dois minutos ou até que a solução esteja límpida para separar os grânulos da solução. Mantenha o tubo no suporte, aspire o sobrenadante transparente com cuidado, sem tocar nas esferas magnéticas, e descarte-o.

Deixe o tubo no suporte, adicione 300 microlitros de etanol a 70% ao tubo e incube as esferas em temperatura ambiente por 30 segundos. Aspire o etanol e descarte-o. Repita esse processo e remova todo o etanol após a segunda lavagem.

Remova o tubo do suporte magnético e seque o conteúdo ao ar por cinco minutos. Adicione 30 microlitros de água de grau molecular às esferas secas e misture pipetando 10 vezes. Incube em temperatura ambiente por dois minutos.

Retorne o tubo ao suporte magnético por um minuto para separar os grânulos da solução. Transferir o eluído para um novo tubo. Meça a concentração final do DNA limpo e agrupado usando um fluorômetro de bancada.

Diluir uma alíquota a 10 nanomolares num volume final de 30 microlitros ou à concentração e ao volume preferidos pela instalação de sequenciação. Após a etapa de amplificação, foi realizado o sequenciamento para determinar a composição da comunidade bacteriana de cada amostra. Um alinhamento da sequência PNA para cada cloroplasto e gene de RNA ribossômico mitocondrial 16S para a planta hospedeira investigada não deve revelar nenhuma incompatibilidade.

Uma única incompatibilidade com a sequência PNA de 13 pares de bases pode reduzir drasticamente a eficácia, como no caso da sequência PNA do cloroplasto fornecida e do gene do RNA ribossômico 16S do cloroplasto de Lactuca sativa, ou alface. Uma vez que uma quantidade igual de DNA amplificado foi agrupada por amostra, um número par de leituras, que correspondem aos táxons bacterianos, foi obtido por amostra após o sequenciamento, classificado com base em seu índice de código de barras. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita para oito plantas em aproximadamente oito horas.

Ao tentar este procedimento, é importante ser consistente entre os experimentos. Pequenos detalhes, como mudanças no método de extração de DNA e mistura principal de PCR, podem introduzir viés. Após esse procedimento, outros métodos, como metatranscriptômica, podem ser usados para responder a perguntas adicionais, como quais micróbios estão ativos e quais genes eles estão expressando?

Não se esqueça de que trabalhar com nitrogênio líquido pode ser extremamente perigoso e precauções como o uso de EPI adequado devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.