小龙虾心脏的连续无创测量与行为活动

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Behavior

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Summary

本文介绍了一种用于小龙虾心脏和运动活动连续记录和分析的无创生物监测系统。该系统由近红外光学传感器、视频跟踪模块和评估小龙虾心跳的软件组成, 该软件反映了小龙虾的生理状态, 并描述了小龙虾在心跳波动期间的行为特征。

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Kuklina, I., Ložek, F., Císař, P., Pautsina, A., Buřič, M., Kozák, P. Continuous Noninvasive Measuring of Crayfish Cardiac and Behavioral Activities. J. Vis. Exp. (144), e58555, doi:10.3791/58555 (2019).

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Abstract

小龙虾是一种重要的水生生物, 既是无脊椎动物行为和生理研究的实用生物模型, 也是水质的有用生物指标。尽管小龙虾不能直接指定导致水质恶化的物质, 但它们可以立即 (在几秒钟内) 通过心脏和行为活动的剧烈变化警告人类水质恶化。

在本研究中, 我们提出了一种非侵入性方法, 由于一个模型结合了简单性和可靠性, 可以在各种条件下实现。

这种将生物生物应用到环境评价过程中的方法, 为警告和防止环境中的急性水恶化提供了可靠和及时的警报。因此, 对这种基于小龙虾生理和伦理参数记录的无创系统进行了研究, 以检测水生环境中的变化。该系统现已应用于当地一家啤酒厂, 用于控制饮料生产用水的质量, 但可用于任何水处理和供水设施, 用于持续、实时的水质评价和定期实验室研究小龙虾心脏生理和行为。

Introduction

水生生物的应用主题, 既是各种实验室调查示范生物 12,也是监测工业和自然环境水质的工具 34, 似乎是很好的研究。然而, 这一主题仍然是人类值得注意的问题, 无论他们是属于科学界还是属于其他职业。尽管存在一些先进的方法来监测某些参数 (所谓的 "生物标志物")5,6, 7,8,选择指标由三个简单因素组成: (一) 简单性, (二) 可靠性, (三) 一般可用性。

小龙虾作为淡水动物的重要代表, 之所以与众不同, 是因为它在世界范围内很普遍, 而且在大多数情况下,9 有足够大和坚硬的甲壳, 适合操作。这种甲壳类动物属于较高的无脊椎动物群体, 它们提供了重要的生理系统和各自器官的充分发展, 同时保持了一个相对简单的组织10

方法在对小龙虾的生物学和行为参数范围进行评估的基础上, 对一般生物监测和小龙虾研究的发展作出了重大贡献。目前可用的小龙虾心率测量侵入性方法大多是基于心电图记录, 需要复杂而精确的外科手术11,12,13;这样的操作可能会对小龙虾造成巨大的压力, 并可能需要长时间的适应。另外, 不知道小龙虾能携带这样的电极多久, 也不知道它在携带这种附件的同时是否会成功蜕皮。所述的无创方法是基于平面记录的, 这由于硬件复杂性而变得复杂, 需要一个信号滤波的调理电路14和一个放大或精确而昂贵的光学元件15 ,16

在这项研究中, 我们描述了一种有助于现有结果的方法, 并为改进当前的小龙虾心率测量程序提供了新的替代方法。在这些优点中, 有 (i) 快速和无创的依恋, 不需要长时间的生理适应;(ii) 小龙虾在从成型到蜕花的几个月内携带传感器的能力;(iii) 能够监测实时心脏和行为活动以及评估同时从多条小龙虾获得的数据的软件;(iv) 制造价格低、简单。我们描述的生物监测系统允许根据小龙虾的伦理生理特性的变化对小龙虾心脏和运动活动进行无创和持续监测。该系统可轻松应用于小龙虾心脏生理和伦理的实验室检查, 以及控制水处理和供水设施水质的工业实施。

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Protocol

1. 小龙虾选择

  1. 为了成功地将目前的方法应用于小龙虾, 请选择具有足够甲壳大小 (甲壳长度至少为30毫米) 的相应成人标本用于传感器附件, 对其是否有疾病进行目视检查, 并进行检查它是否在触摸时将两个切菜都抬起。上述参数表明小龙虾健康状况合格。
    请注意:如果在试验中预计将使用几条小龙虾, 并暴露在相同的条件下, 应根据几个参数形成实验组: (一) 重量和长度相似;(ii) 可比较的心率;(iii) 明显的夜间活动;(iv) 定期食用食物;(v) 模间成型期17。有时, 很难通过心率测量或视觉或触觉检查来确定小龙虾是否接近蜕皮;因此, 对小龙虾血淋巴总蛋白含量的分析是有帮助的。当小龙虾更接近蜕皮时, 蛋白质含量有望高于模间状态18

2. 记录小龙虾心脏活动和行为

  1. 为了非侵入性地测量小龙虾心率, 初步准备传感器为此做法。在此之前, 用清水将小龙虾放入水箱中, 让它在那里适应几天, 因为传感器1 9 的准备也需要几天时间。
    1. 轴向耦合红外发光二极管 (led) 与光电晶体管。将光学传感器电路连接到电路板上;它将需要 5 v 的电源。对于 led 连接, 在红外传感器板上放置一个200ω电阻器;为了连接光电晶体管, 在电路板上放置一个220ω电阻器。
    2. 当连接到小龙虾时, 传感器的输出被填充小龙虾心肌的血淋巴量调节, 并从 led 散射入射光。为了避免 led 照明的红外光和来自小龙虾心脏的反射红外光 (由光电晶体管接收) 的相互干扰, 放置一个由黑色抗静电塑料制成的小壁 (0.5 x 1.5 x 4 毫米, 厚度 x 高度 x 宽度)在 led 和光电晶体管之间。
    3. 将 led 放在防水封装中, 并将防水介电凝胶从甲壳相邻的一侧覆盖传感器表面, 以保护电子元件免受潜在损坏 (图 1)。让凝胶干燥 3天, 以获得其最佳的保护性能。
    4. 对于模拟信号, 将薄柔性电缆 (长约3米) 连接到传感器, 并连接到模数转换器 (adc);由此, 数字化信号将通过 usb 接口传输到个人电脑, 此时将保存有关小龙虾心脏活动的信息, 使用特殊软件实时分析 (见材料表), 并存储在进一步的详细分析。
  2. 一旦传感器准备好了, 就把它贴在小龙虾上。为此, 请打开计算机并运行软件。确定要固定在传感器上的小龙虾数量, 并记录要保存到日期文件的心率。
  3. 将小龙虾从水中取出, 用纸巾擦拭其背带侧。用纸巾包裹小龙虾的切罗和腹部, 以避免人的手造成任何损害, 并消除温暖的人的手对小龙虾造成的额外压力。
    请注意:在使用传感器附件操作之前, 不要在冰上或冰柜中使用以前的小龙虾冷却, 以实现其固定化。温度的差异导致小龙虾背侧表面哭泣, 进而导致不可靠的传感器紧固和快速粘合脱离小龙虾的甲壳。
  4. 准备一个表面 (即, 拿一小块扁平的塑料或撕下一块胶带, 并将其固定在一张桌子上) 和一根用来混合胶水的棍子。从含有环氧胶的 a 管和 b 管中挤出两滴小滴 (直径约0.5 厘米), 并迅速将它们混合。
  5. 将传感器连接到小龙虾背侧甲壳, 并尝试找到心脏信号振幅最大的位置。用一只手拿着传感器, 用另一只自由的手, 在传感器上的四根辅助电线上每条线上放一滴混合胶 (将它们固定在步骤2.1.1 和2.1.4 之间)。在胶水变硬 (胶水硬化取决于环境温度和湿度) 之前, 不要移动传感器至少5分钟。
    请注意:将传感器固定在小龙虾甲壳上时, 请从甲壳侧彻底检查整个心脏区域, 以便以最佳 (最大) 心脏信号振幅确定区域。这将有助于软件提供更精确的心率计算。
  6. 用自由的手触摸胶水, 如果它不是粘的, 把未包裹的小龙虾与连接的传感器 (图 2) 到盒子里几分钟没有水, 直到胶水完全干燥。
    请注意:小龙虾和胶水操作的最佳温度从18°c 到22°c 不等。在这些温度下, 胶水在5至7分钟内变硬, 在8至10分钟内完全干燥。在较低的温度下, 小龙虾的应力不太明显;然而, 胶水需要更多的时间硬化, 大约15分钟和20分钟的15°c 和10°c 下, 分别。在较高的温度下, 特别是在25°c 以上, 胶水在3分钟内变硬, 但小龙虾承受的压力要大得多;因此, 尽量减少甲壳类动物在没有水的极端条件下的暴露。
  7. 在将小龙虾移回水箱之前, 将其头胸多次浸入水中, 间隔很短, 时间间隔为几秒钟, 以便能够排出在中积累的空气, 并将小龙虾留在水中约 1小时, 以去除任何多余的化学品。在这个过程完成后, 将小龙虾释放到水中, 并根据观察到的生理指标, 使小龙虾在实验条件下适应一至两周。在适应期间的最佳水交换是每隔一天。
    请注意:已适应并处于健康状态的小龙虾的特征包括明显的生理心脏和运动活动、经常的食物消耗以及在专门的庇护所 (如果提供) 花费大部分日光。

3. 相机和软件设置

  1. 启动软件;摄像机将自动打开。
  2. 选择一个运动检测选项, 彻底检测屏幕上每个坦克的区域, 软件将开始跟踪行为, 并将其与心脏活动记录链接。
    请注意:小龙虾运动检测模块由摄像机和将这种行为与心脏活动结合起来的软件组成, 摄像机可跟踪小龙虾的行为。该模块中的数据用于消除小龙虾在机车活动频繁时, 从而实现更精确的心脏活动数据处理。突然的小龙虾运动 (即逃逸反应或喂养启动) 可能会导致心脏信号的波动或短时间尖峰, 这可能会降低心脏间隔计算的精度。

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Representative Results

因此, 我们获得了小龙虾心脏和行为活动的组合, 记录并保存在 txt 格式的文件中 (图 3)。除了实验小龙虾的数量、日期和采样率外, 该文件还包括三列: (1) 以 hh:mm:ss 格式连续的时间;(2) 心率以每分钟节拍自动计算;(3) 登记为没有 (0) 或存在任何运动的运动。当小龙虾处于非活动状态时, 将零分配给负责移动的细胞, 当它移动时, 第一个就出现在各自的细胞中。连续录制时, 每天在 00:00 (12:00 am) 自动创建数据文件。包括运动是至关重要的, 因为它可能会导致心率的变化 (图 4)。10秒后, 食物气味 (磨碎、过滤和稀释的幼虫) 被输送到装有小龙虾的鱼缸中, 使用的是蠕动泵。在14岁时, 小龙虾识别出刺激, 由于所谓的定向反应, 它的心跳率略有下降。2 0 后, 心跳加快, 导致心脏间隔缩短。26秒时, 小龙虾向刺激源移动, 食物气味引起的生理兴奋和运动萌发都会导致心率大幅增加。37岁时, 也有证据表明小龙虾突然运动。此外, 在小龙虾对某些刺激的反应过程中, 运动可能会极大地促进心率的增长 (图 5)。受干扰的小龙虾通常会增加心跳率, 就像在 3 0 到 4 0分钟的间隔内偶尔运动一样。然而, 在45至50分钟的间隔内, 运动要明显得多。这种运动导致的心跳率明显高于运动减少期间的心跳率。如果将文件中的数据传输到另一个应用程序或使用上述编程算法, 则可以获得仅包含小龙虾心脏活动的数据, 并在必要时随后进行处理 (图 6)。未受干扰小龙虾的心率特征是心跳曲线的单调振幅, 以及每个心脏峰之间的心脏间隔大致相等。

为了分析小龙虾的行为模式 (如经过的距离、在水箱或竞技场中的某一区域的偏好以及运动速度), 可以用带有平面广角镜头的标准摄像机交换当前的摄像机, 如目前使用的相机不做录音, 但只是跟踪运动。或者, 可以使用任何在线应用程序的录音, 以便从屏幕上捕捉视频。

Figure 1
图 1: 无创红外光电传感器.请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 信号小龙虾,松尾鱼, 将传感器固定在其甲壳上。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 数据文件的示例.请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 在接触食物气味时, 小龙虾在从正常状态转变为干扰状态时心跳.请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5: 小龙虾在不受干扰 (0-30分钟) 和受干扰 (30-60分钟) 条件下的心率和运动活动.请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 6
图 6: 未受干扰的小龙虾心率.请点击这里查看此图的较大版本.

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Discussion

人们普遍认为, 测量某些生理参数 (如心脏或通气率或两者兼而有之) 是记录小龙虾反应的更可靠的方法, 而不是对并不总是发生的行为反应的评价立刻11。然而, 评估小龙虾对环境变化的真正反应的最有效方法显然是心脏活动和行为记录的结合, 因为这样就可以看到小龙虾心跳的原因这些变化是否因周围环境的化学变化或运动的开始而发生。在水质监测过程中, 至关重要的是要消除外界对小龙虾生理标记变化的所有影响, 包括对心率的影响越来越大但不会对生物监测系统产生警报的突然运动。

促进更精确和信息丰富的心跳评估的另一种可能性是对小龙虾心脏活动的时间和各向异性参数分析, 主要与小龙虾心脏信号19中的特定形状有关。这样的分析证实, 即使心跳每分钟只改变几次节拍, 一些二级参数也能表明小龙虾心脏活动显著变化。

尽管使用所述方法有很多好处, 但围绕监测小龙虾的研究已朝着绝对最小化触觉小龙虾操作的方向发展。在最近开发的非接触式系统20中, 消除传感器及其各自的电线意味着任何尺寸的小龙虾都可以用于监测程序。也可以将多条小龙虾放在一个实验区域, 因为没有任何电线可以防止电线缠绕和小龙虾的运动限制。小龙虾将携带两个微小的碎片的高度反光磁带, 表明其心脏面积。即使在成型后的几天后, 这些胶带也可以贴在小龙虾上。用摄像机记录小龙虾的心脏活动和行为, 并通过协调软件进行实时分析。与其他技术进步一样, 修改后的方法将导致监测系统的价格因硬件有限而大幅下降。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项研究得到了捷克共和国教育、青年和体育部 "cenakva" 项目 "cenakva" 项目的支持。CZ.1.05/2.1.00/01.0024 和 "cenakva ii" 否。根据国家可持续发展方案 i, 由捷克布杰约维采的南波希米亚大学赠款机构 (012/2016/z) 和捷克共和国赠款机构 (16-06498s 号) 提交

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IR LED diode KINGBRIGHT ELECTRONIC KP-3216F3C
Phototransistor EVERLIGHT ELPT15-21C
Resistor ROYAL OHM 0805S8J0201T5E
Resistor ROYAL OHM 0805S8F2200T5E
Capacitor KEMET C0805C334K5RACTU
Cable TECHNOKABEL FTP KAT.5E 4X2X0,14C
Connector HARTING 21348100380005
Connector HARTING 21348000380005
Dielectric gel KRAYDEN Sylgard 535
Analogue-to-digital convertor TEDIA UDAQ-1416CA
Glue KUPSITO.SK 7338723044
Kinect video camera ABCSTORE.CZ GT3-00002
Analysis software University of South Bohemia in Ceske Budejovice, Faculty of Fisheries and Protection of Waters, Institute of Complex Systems Link to the software: www.frov.jcu.cz/crayfishmonitoring
User name: frov
Password: CF2018

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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