Continua la misurazione non invasiva dell'attività cardiaca e comportamentali di gamberi

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Behavior

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Summary

Questo articolo presenta un sistema di biomonitoraggio non invadente per la registrazione continua e l'analisi dell'attività cardiaca e locomotore gamberi. Questo sistema è costituito da un sensore ottico infrarosso, un modulo di rilevamento video e software per la valutazione di battiti cardiaci gamberi che riflette il suo stato fisiologico e caratterizza il comportamento di gamberi durante le fluttuazioni di battito cardiaco.

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Kuklina, I., Ložek, F., Císař, P., Pautsina, A., Buřič, M., Kozák, P. Continuous Noninvasive Measuring of Crayfish Cardiac and Behavioral Activities. J. Vis. Exp. (144), e58555, doi:10.3791/58555 (2019).

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Abstract

Un gambero di fiume è un organismo acquatico cardine che serve sia come un pratico modello biologico per studi comportamentali e fisiologici di invertebrati come un utile indicatore biologico della qualità delle acque. Anche se gamberi non è possibile specificare direttamente le sostanze che causano il deterioramento della qualità dell'acqua, si possono immediatamente (entro pochi secondi) avvertono gli esseri umani di deterioramento della qualità dell'acqua tramite cambiamenti acuti nella loro attività cardiaca e comportamentali.

In questo studio, presentiamo un metodo non invasivo che è abbastanza semplice da attuare nelle varie circostanze a causa di una combinazione di semplicità e affidabilità in un modello.

Questo approccio, in cui gli organismi biologici vengono implementati nei processi di valutazione ambientale, fornisce un affidabile e tempestivo allarme per l'allarme e prevenendo il deterioramento acuto dell'acqua in un ambiente. Pertanto, questo sistema non invasivo basato su gamberi fisiologici e registrazioni di parametro etologico è stato studiato per la rilevazione dei cambiamenti nell'ambiente acquatico. Questo sistema è ora applicato a una birreria locale per il controllo della qualità dell'acqua utilizzata per la produzione di bevande, ma può essere utilizzato in qualsiasi trattamento dell'acqua e l'impianto per l'approvvigionamento per la valutazione della qualità dell'acqua di continuo, in tempo reale e per laboratorio regolare indagini di fisiologia cardiaca gamberi e comportamento.

Introduction

Oggetto di domande gli organismi acquatici sia come organismi modello per1,varie indagini di laboratorio2 strumenti per il monitoraggio industriale e naturale/ambientale acqua qualità3,4 , sembra essere ben studiato. Tuttavia, questo argomento è ancora di notevole interesse per gli esseri umani, indipendentemente dalla loro appartenenza alla comunità scientifica o ad altre occupazioni. Nonostante l'esistenza di un certo numero di metodi avanzati per il monitoraggio di alcuni parametri (cosiddetti "biomarcatori")5,6,7,8, i requisiti più importanti per la selezione di un indicatore è costituito da tre semplici fattori: (i) semplicità, (ii) affidabilità e disponibilità (iii) generale.

Gamberi di fiume, come un essenziale rappresentante della fauna d'acqua dolce, si distingue perché si trova in tutto il mondo, è molto diffusa e, nella maggior parte dei casi9, ha un carapace sufficientemente grande e duro adatto per la manipolazione. Questo crostaceo appartiene al gruppo degli invertebrati superiori che forniscono sufficienti dello sviluppo di sistemi fisiologici vitali e rispettivi organi mentre, allo stesso tempo, mantenendo un' organizzazione relativamente semplice10.

Metodi basati sulla valutazione della gamma di parametri biologici e/o comportamentali dei gamberi, come descritto nella letteratura scientifica, hanno contribuito significativamente allo sviluppo di studi di biomonitoraggio e gamberi di fiume in generale. La maggior parte dei metodi invasivi attualmente disponibili per le misure di frequenza cardiaca di gamberi sono basata sulle registrazioni elettrocardiogramma che richiedono una procedura chirurgica complessa e precisa11,12,13; tali manipolazioni possono causare notevole stress a e possono richiedere adattamento prolungato dal Gambero di fiume. Inoltre, non è noto come lungo un gambero può trasportare tali elettrodi e se esso verrà correttamente muta mentre lo si trasporta questo attaccamento. I metodi descritti non invadenti sono basati sulle registrazioni pletismografica, che sono complicate dalla complessità dell'hardware e richiedono un circuito condizionata per segnale filtraggio14 e un'amplificazione o precisione e costose componenti ottiche15 ,16.

In questo studio, abbiamo descritto un approccio che contribuisce ai risultati esistenti e offre nuove alternative per migliorare le attuali procedure di misurazione frequenza cardiaca di gamberi. Tra i vantaggi, ci sono (i) un collegamento veloce e non invasivo che non richiede un adattamento fisiologico prolungato; (ii) capacità di gamberi portare il sensore entro un periodo di pochi mesi da muta a muta; (iii) il software in grado di monitoraggio cardiaco in tempo reale e comportamentali attività e la valutazione dei dati ottenuti simultaneamente da più gambero di fiume; (iv) una produzione basso prezzo e la semplicità. Il sistema di biomonitoraggio che descriviamo consente la non invadente e continuo monitoraggio delle attività di gamberi cardiache e dell'apparato locomotore basata sui cambiamenti nelle caratteristiche etho-fisiologiche degli astaci. Questo sistema può essere applicato facilmente negli esami del laboratorio di fisiologia cardiaca gamberi e/o etologia, oltre alle implementazioni industriali per il controllo di qualità delle acque: Servizi di trattamento e fornitura di acqua.

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Protocol

1. gamberi selezione

  1. Per applicare con successo l'attuale approccio per aragoste, selezionare i rispettivi esemplari adulti con sufficienti dimensioni di carapace (che è una lunghezza del carapace di almeno 30 mm) per il fissaggio del sensore, visivamente esaminarlo per l'assenza di malattie e verifica Se si solleva entrambe chelae quando viene toccata. I parametri suddetti indicano uno stato ammissibile della salute di gamberi.
    Nota: Se diversi gamberi dovrebbero essere utilizzati nella sperimentazione e sono esposti alle stesse condizioni, il gruppo sperimentale dovrebbe essere formato sulla base di diversi parametri: (i) simile peso e lunghezza; (ii) frequenza cardiaca comparabile; (iii) pronunciata attività notturna; (iv) consumo alimentare regolari; (v) Inter-muta periodo17. A volte, è difficile da definire se un gambero di fiume è vicino alla muta dalle misurazioni della frequenza cardiaca o visivo o tattili esami solo; di conseguenza, l'analisi del contenuto proteico totale del gambero di fiume emolinfa possono essere utile. Contenuto proteico dovrebbe essere più elevato quando il gambero di fiume è più vicino alla muta rispetto a Inter-muta stato18.

2. registrazione del comportamento e l'attività cardiaca di gamberi

  1. Al fine di non invadente misurare i tassi di cuore di gamberi, preliminarmente preparare il sensore per questa procedura. Prima di questo, mettere un gambero di fiume nel serbatoio con acqua e lasciare acclimatare lì per pochi giorni, come la preparazione del sensore19 avrà anche un paio di giorni.
    1. Coppie assialmente un IR diodo luminoso (LED) con un fototransistor. Fissare il circuito sensore ottico su una scheda; richiederà un rifornimento di alimentazione di 5 V. Per il collegamento di LED, posto una resistenza di 200 Ω sul bordo del sensore IR; al fine di collegare il Fototransistor, collocare un resistore 220 Ω sulla scheda.
    2. Quando collegato al Gambero di fiume, l'uscita del sensore è modulato dalla quantità di emolinfa riempimento il muscolo cardiaco di gamberi e diffonde una luce incidente dal LED. Al fine di evitare interferenze reciproche di illuminata IR luce dal LED e la luce dal cuore di gamberi di fiume, che viene ricevuto dal fototransistor, IR riflessa posto una piccola parete (0,5 x 1,5 x 4 mm, spessore x altezza x larghezza) in plastica nera antistatica tra il LED e fototransistor.
    3. Posizionare i LED in una confezione impermeabile e coprire la superficie del sensore con il gel dielettrico impermeabile dal lato adiacente al carapace per la protezione dei componenti elettronici da eventuali danni (Figura 1). Asciugare il gel per 3 giorni al fine di ottenere le migliori proprietà protettive.
    4. Per un segnale analogico, collegare il cavo flessibile sottile (circa 3 m di lunghezza) il sensore e collegare al convertitore analogico-digitale (ADC); da questo, un segnale digitalizzato sarà trasferito ad un personal computer tramite un'interfaccia USB, a che indicano le informazioni sul Gambero di fiume viene salvato l'attività cardiaca, analizzati in tempo reale con un software speciale (Vedi Tabella materiali) e conservati per Ulteriori analisi dettagliate.
  2. Non appena il sensore è preparato, allegarlo per le aragoste. A tale scopo, è necessario accendere il computer ed eseguire il software. Determinare il numero di gamberi da fissare i sensori e la frequenza cardiaca registrata per essere salvati nel file Data.
  3. Rimuovere il gambero di fiume dall'acqua e pulire il suo lato dorsale del carapace con un tovagliolo di carta. Avvolgere il chelae e l'addome del gambero nel tovagliolo di carta per evitare eventuali danni da mano umana e per eliminare lo stress aggiuntivo sul Gambero di fiume causato dalle mani dell'uomo calde.
    Nota: Non utilizzare un raffreddamento precedente di gamberi su ghiaccio o nel congelatore per sua immobilizzazione prima di manipolazioni con il collegamento del sensore. La differenza di temperatura conduce al gamberi dorsale superficiale piangente che, a sua volta, conduce a fissaggio sensore inaffidabile e adesivo rapido distacco dal carapace di gamberi di fiume.
  4. Preparare una superficie (cioè, prendere un piccolo pezzo di plastica o strappare un pezzo di nastro adesivo e fissarlo a una tabella) e un bastone per mescolare la colla. Premere fuori due piccole gocce (di un diametro di circa 0,5 cm) da tubi A e colla a resina epossidica contenente B e mescolare rapidamente.
  5. Applicare il sensore al carapace dorsale gamberi e cercare di trovare il luogo in cui l'ampiezza del segnale cardiaco sarebbe massima. Tenere il gambero di fiume con il sensore in una mano e, utilizzando la mano libera, mettere una goccia di colla mista su ciascuno dei quattro fili ausiliari situati sul sensore (difficoltà tra passaggi 2.1.1 e 2.1.4.). Non spostare il sensore almeno 5 min fino a quando la colla indurisce (l'indurimento della colla dipende la temperatura e l'umidità).
    Nota: Nel fissare il sensore per il carapace di gamberi, esaminare accuratamente la zona intera cardiaca dal lato carapace al fine di definire l'area con la migliore ampiezza del segnale cardiaco (massima). Che aiuterà il software per fornire calcoli più precisi di frequenza cardiaca.
  6. Toccare la colla utilizzando una mano libera e se non è appiccicoso, mettere i gamberi non confezionati con sensore collegato (Figura 2) nella casella senza acqua per qualche minuto fino a quando la colla è completamente asciutta.
    Nota: Una temperatura ottimale per la manipolazione di gamberi e colla varia da 18 a 22 ° C. A queste temperature, la colla indurisce entro 5-7 min e sia completamente asciutta entro 8-10 min. A temperature più basse, lo stress nel Gambero di fiume è meno pronunciato; Tuttavia, la colla ha bisogno di più tempo per indurire, circa 15 e 20 min sotto 15 ° C e 10 ° C, rispettivamente. A temperature più elevate, specialmente di sopra di 25 ° C, la colla indurisce entro 3 min, ma il gambero di fiume viene sottoposto a sollecitazioni molto di più; quindi, cercare di ridurre al minimo l'esposizione del crostaceo in condizioni estreme senza acqua.
  7. Prima di spostare il gambero di fiume torna nel serbatoio, immergere il suo cefalotorace nell'acqua diverse volte con brevi intervalli di pochi secondi al fine di consentire uno scarico dell'aria che si è accumulato nelle branchie, e lasciare il gambero di fiume in acqua per circa 1 h per rimuovere eventuali sostanze chimiche in eccesso. Dopo questo processo è completo, rilasciare i gamberi in acqua e attendere che raggiunga per una o due settimane in condizioni sperimentali, a seconda di indici fisiologici osservati. Scambio di acqua ottimale durante i periodi di acclimatazione è a giorni alterni.
    Nota: Le caratteristiche di gamberi che siano acclimatati e sono in uno stato di salute includono cardiaco circadiano pronunciato e attività locomotrice, il consumo di cibo normale e trascorrere la maggior parte del giorno in un rifugio specializzato (se previsto).

3. fotocamera e configurazione del Software

  1. Avviare il software; la videocamera si accenderà automaticamente.
  2. Selezionare un'opzione di rilevamento del movimento, rilevare accuratamente la zona di ogni serbatoio sullo schermo e il software inizierà il comportamento di rilevamento e collegandolo con le registrazioni di attività cardiaca.
    Nota: Un modulo di rilevamento del movimento di gamberi è costituito da una videocamera che registra il comportamento di gamberi da sotto il serbatoio e il software che combina il comportamento con attività cardiaca. I dati del modulo vengono utilizzati per facilitare l'elaborazione di dati più preciso l'attività cardiaca eliminando i periodi in cui il gambero di fiume viene illustrato locomotiva ad alta attività. Movimenti improvvisi gamberi (cioè, una reazione di fuga o l'inizio di alimentazione) possono causare sbalzi o picchi di breve durata in segnali cardiaci che possono ridurre la precisione dei calcoli di intervallo cardiaco.

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Representative Results

Di conseguenza, abbiamo ottenuto una combinazione di gamberi attività cardiaca e comportamentali, registrate e salvate in un file di formato txt (Figura 3). Oltre al numero di gamberi sperimentali, la data e la frequenza di campionamento, il file è costituito da tre colonne: (1) l'orario continuo in formato HH; (2) la frequenza cardiaca viene calcolata automaticamente in battiti al minuto; (3) la locomozione registrato come assenza (0) o presenza (1) di qualsiasi movimento. Quando il gambero era inattivo, zero è stato assegnato alla cella responsabile del movimento, e quando si è mosso, poi numero uno è apparso nella rispettiva cella. Quando si registra continuamente, il file di dati è stato creato automaticamente ogni giorno alle ore 00:00 (12:00 AM). E ' stato fondamentale per comprendere la locomozione poiché potrebbe avere causato cambiamenti nella frequenza cardiaca (Figura 4). Dopo 10 s, un odore di cibo (larve di Chironomidae fresate, filtrate e diluite) è stato consegnato nel serbatoio contenente il gambero di fiume, utilizzando una pompa peristaltica. 14 s, il gambero di fiume riconosciuto lo stimolo e la sua frequenza cardiaca leggermente diminuita a causa della cosiddetta risposta orientante. Dopo 20 s, la frequenza cardiaca è aumentato, così con conseguente una diminuzione negli intervalli cardiaci. 26 s, il gambero di fiume si mosse verso la fonte di stimolo ed entrambi l'eccitazione fisiologica causata dall'odore di cibo e l'iniziazione di locomozione ha provocato un aumento sostanziale di frequenza cardiaca. 37 s, ci era inoltre prova di movimento brusco gamberi. Inoltre, locomozione poteva aver contribuito sostanzialmente alla crescita di frequenza cardiaca durante le reazioni di gamberi a determinati stimoli (Figura 5). Un gambero di fiume disturbato ha in genere un aumento della frequenza cardiaca, come si è visto durante l'intervallo di 30-40 min con locomozione occasionale. Tuttavia, durante l'intervallo di 45-50 min, la locomozione è più pronunciata. Questa locomozione ha contribuito a una frequenza cardiaca che è significativamente superiore a quello visto durante il periodo con locomozione in diminuzione. Se i dati dal file viene trasferiti a un'altra applicazione o viene utilizzato l'algoritmo di programmazione precedente, i dati che contengono solo l'attività cardiaca del gambero potrebbero essere ottenuti e successivamente trattati se necessario (Figura 6). La frequenza cardiaca di gamberi indisturbati è caratterizzata da un'ampiezza monotona della curva battito cardiaco e di approssimativamente uguale cardiaci intervalli tra ogni picco cardiaco.

Al fine di analizzare i modelli comportamentali di gamberi (come passato distanza, preferenza di una determinata area nella velocità serbatoio o arena e locomozione), sarebbe possibile scambiare la fotocamera attuale con una videocamera standard con un obiettivo grandangolare piatta, come il macchina fotografica usata attualmente non fa una registrazione ma solo canzoni di locomozione. In alternativa, potrebbe essere usata una registrazione con una qualsiasi delle applicazioni online per la cattura di un video dallo schermo.

Figure 1
Figura 1 : Sensore optoelettronico a infrarossi non invadente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Segnale di gamberi di fiume, Pacifastacus leniusculus, tiene il sensore sul suo carapace. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Un esempio del file di dati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 : Battito cardiaco gamberi durante il cambiamento da normale a disturbato condizioni quando esposto agli odori di cibo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5 : Frequenza cardiaca e attività di locomozione di un gambero di fiume in condizioni disturbate (30 – 60 min) e indisturbati (0 – 30 min). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6 : Frequenza cardiaca gamberi indisturbato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Ampiamente è stato suggerito che la misura di alcuni parametri fisiologici (ad esempio cuore o tasso di ventilazione o entrambi) è un metodo più affidabile per la registrazione delle reazioni di gamberi che la valutazione delle risposte comportamentali che non sempre si verificano immediatamente11. Tuttavia, è evidente che l'approccio più efficace per valutare le reazioni di gamberi reali ai cambiamenti ambientali è la combinazione di attività cardiaca e registrazioni di comportamento, dal momento che rende possibile vedere i motivi per l'heartbeat di gamberi modifiche e se non si verificano a seguito di alterazioni chimiche nell'ambiente ambiente o a causa di iniziazione di locomozione. Durante il monitoraggio della qualità dell'acqua, è fondamentale eliminare tutte le influenze esterne sui cambiamenti nei marcatori fisiologici di gamberi di fiume, tra cui movimenti bruschi che hanno crescenti effetti sulla frequenza cardiaca, ma non presentano un allarme per il sistema di biomonitoraggio.

Un'altra possibilità per facilitare una valutazione più precisa e informativo di battito cardiaco sono il parametro inotropo analisi di gamberi attività cardiaca principalmente legate a specifiche forme di gamberi segnali cardiaci19e cronotropa. Tali analisi hanno confermato che anche quando il battito cardiaco ha cambiato solo poche battiti al minuto, alcuni dei parametri secondari possono indicare cambiamenti significativi nei gamberi attività cardiaca19.

Nonostante il numero di prestazioni utilizzando l'approccio descritto, ricerca intorno monitoraggio gamberi si è mossa verso un assoluto minimizzazione delle manipolazioni tattili gamberi. Nel sistema contactless recentemente sviluppato20, l'eliminazione di sensori e loro rispettivi cavi significa gamberi di qualsiasi dimensione possono essere utilizzati per la procedura di controllo. È anche possibile mantenere più gamberi di fiume in una zona sperimentale poiché impedisce l'assenza di qualsiasi fili filo grovigli e restrizioni di movimento del gambero di fiume. Il gambero di fiume porterà solo due piccoli pezzi di un nastro altamente riflettente che indica la sua zona cardiaca. Questi pezzi di nastro possono essere collegati per le aragoste anche dopo pochi post-muta giorni. Attività cardiaca gamberi e comportamenti sono registrati dalla videocamera e analizzati tempo reale dal software di coordinamento. Insieme ad altri progressi tecnici, l'approccio modificato causerà una diminuzione significativa del prezzo del sistema di monitoraggio a causa della limitata sull'hardware.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Questo studio è stato sostenuto dal Ministero della pubblica istruzione, gioventù e dello sport della Repubblica Ceca-progetti "CENAKVA" No. CZ.1.05/2.1.00/01.0024 e 'CENAKVA II ' n. LO1205 sotto la sostenibilità nazionale programma I, Grant dell'Agenzia dell'Università della Boemia meridionale a České Budějovice (012/2016/Z) e dall'Agenzia Grant della Repubblica Ceca (n. 16-06498S)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IR LED diode KINGBRIGHT ELECTRONIC KP-3216F3C
Phototransistor EVERLIGHT ELPT15-21C
Resistor ROYAL OHM 0805S8J0201T5E
Resistor ROYAL OHM 0805S8F2200T5E
Capacitor KEMET C0805C334K5RACTU
Cable TECHNOKABEL FTP KAT.5E 4X2X0,14C
Connector HARTING 21348100380005
Connector HARTING 21348000380005
Dielectric gel KRAYDEN Sylgard 535
Analogue-to-digital convertor TEDIA UDAQ-1416CA
Glue KUPSITO.SK 7338723044
Kinect video camera ABCSTORE.CZ GT3-00002
Analysis software University of South Bohemia in Ceske Budejovice, Faculty of Fisheries and Protection of Waters, Institute of Complex Systems Link to the software: www.frov.jcu.cz/crayfishmonitoring
User name: frov
Password: CF2018

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