Mesure non invasive en continu des activités cardiaques et comportementales d’écrevisses

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Behavior

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Summary

Cet article présente un système de biosurveillance non invasive pour l’enregistrement continu et analyses des activités cardiaques et locomotrice des écrevisses. Ce système se compose d’un capteur optique infrarouge proche, un module de suivi vidéo et logiciel d’évaluation des pulsations d’écrevisses qui reflète son état physiologique et caractérise le comportement de l’écrevisse pendant des fluctuations du rythme cardiaque.

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Kuklina, I., Ložek, F., Císař, P., Pautsina, A., Buřič, M., Kozák, P. Continuous Noninvasive Measuring of Crayfish Cardiac and Behavioral Activities. J. Vis. Exp. (144), e58555, doi:10.3791/58555 (2019).

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Abstract

L’écrevisse est un organisme aquatique pivot qui sert tant qu’un modèle biologique pratique pour des études comportementales et physiologiques des invertébrés et utile indicateur biologique de qualité de l’eau. Même si les écrevisses ne peuvent pas spécifier directement les substances qui causent la détérioration de la qualité l’eau, ils peuvent immédiatement (dans les quelques secondes) avertissent humains de la détérioration de la qualité l’eau via les changements aigus dans leurs activités cardiaques et comportementales.

Dans cette étude, nous présentons une méthode non invasive qui est assez simple à mettre en œuvre dans des conditions différentes en raison d’une combinaison de simplicité et de fiabilité dans un seul modèle.

Cette approche, dans laquelle les organismes biologiques sont mises en œuvre dans les processus d’évaluation environnementale, fournit une alarme fiable et opportune pour l’alerte et prévenir la détérioration aiguë de l’eau dans un environnement ambiant. Par conséquent, ce système non invasif issu des écrevisses physiologiques et enregistrements éthologiques paramètre a été étudié pour la détection des changements dans un environnement aquatique. Ce système est maintenant appliqué dans une brasserie locale pour le contrôle qualité de l’eau utilisée pour la production de boissons, mais il peut être utilisé à tout traitement de l’eau et la facilité d’approvisionnement pour l’évaluation de la qualité continue et en temps réel de l’eau et pour le laboratoire régulier études du comportement et la physiologie cardiaque écrevisses.

Introduction

L’objet de demandes d’organismes aquatiques, comme les organismes modèles pour divers laboratoire enquêtes1,2 et comme outils de surveillance des eaux industrielles et naturelles/environnement qualité3,4 , semble être bien étudiée. Néanmoins, ce sujet est toujours d’intérêt remarquable pour les humains, qu’ils appartiennent à la communauté scientifique ou à d’autres métiers. En dépit de l’existence d’un certain nombre de méthodes de pointe pour la surveillance de certains paramètres (ce que l'on appelle « biomarqueurs »)5,6,7,8, les exigences les plus importantes pour choisir un voyant se composent de trois éléments simples : simplicité (i), (ii) fiabilité et disponibilité (iii) générale.

Écrevisses, comme un représentant essentiel de la faune d’eau douce, se distingue parce qu’il se trouve dans le monde entier, est très répandue et, dans la plupart des cas9a une carapace suffisamment gros et dure adaptée pour la manipulation. Ce crustacé appartient au groupe des invertébrés supérieurs qui fournissent un développement suffisant des systèmes physiologiques vitaux et organes respectifs tandis que, dans le même temps, maintenir une organisation relativement simple10.

Méthodes basées sur l’évaluation de l’éventail des paramètres biologiques et comportementales des écrevisses comme décrit dans la littérature scientifique, ont grandement contribué à l’élaboration des études de biosurveillance et écrevisses en général. La plupart des méthodes invasives actuellement disponibles pour les mesures de la fréquence cardiaque d’écrevisses est basée sur les enregistrements ECG nécessitant une intervention chirurgicale complexe et précis11,12,13; ces manipulations peuvent provoquer un stress important à et peuvent nécessiter l’adaptation prolongée par l’écrevisse. En outre, on ne sait pas comment long une écrevisse peut transporter ces électrodes et si il va muer avec succès tout en menant une telle fixation. Les méthodes non invasives décrites reposent sur des enregistrements pléthysmographique, qui sont compliquées par la complexité matérielle et exige un circuit de conditionnement de signal filtrage14 et une amplification ou composants optiques précis et chers15 ,,16.

Dans cette étude, nous avons décrit une approche qui contribue aux résultats existants et offre de nouvelles alternatives pour améliorer les procédures actuelles de mesure de fréquence cardiaque écrevisses. Parmi les avantages, il y a (i) une fixation rapide et non invasive qui ne nécessite pas une adaptation physiologique prolongée ; II capacité des écrevisses pour transporter le capteur dans un délai de quelques mois de mue à la mue ; (iii) le logiciel capable de surveiller en temps réel cardiaque et activités comportementales et l’évaluation des données obtenues simultanément par plusieurs écrevisse ; (iv) une fabrication faible prix et simplicité. Le système de biosurveillance qui nous décrivent permet la non invasive et continue la surveillance des activités cardiaques et locomotrice écrevisses, basées sur les changements dans les caractéristiques etho-physiologiques des écrevisses. Ce système peut facilement être appliqué dans les examens de laboratoire de la physiologie cardiaque écrevisses et/ou l’éthologie, en plus des implémentations industrielles pour le contrôle qualité de l’eau dans les installations de traitement et d’approvisionnement en eau.

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Protocol

1. sélection d’écrevisses

  1. Afin d’appliquer avec succès l’approche actuelle d’écrevisses, sélectionner les spécimens adultes respectifs avec des tailles de carapace suffisante (ce qui est d’une longueur de la carapace d’au moins 30 mm) pour la fixation de la sonde, visuellement l’examiner pour l’absence de maladies et vérifier Si elle lève les deux pinces quand il est touché. Les paramètres mentionnés ci-dessus indiquent un État admissible de la santé de l’écrevisse.
    Remarque : Si plusieurs écrevisses sont censés être utilisés pour l’essai et sont exposés aux mêmes conditions, le groupe expérimental doit être formé basé sur plusieurs paramètres : (i) similaires de poids et de longueur ; (ii) comparable fréquence cardiaque ; (iii) l’activité nocturne prononcée ; (iv) la consommation d’aliments régulière ; (v) la mue période17. Parfois, il est difficile de définir si l’écrevisse est proche de mue par les mesures de la fréquence cardiaque ou les examens visuels ou tactiles seulement ; les analyses de la teneur en protéines totales de l’écrevisse hémolymphe peuvent donc s’avérer utiles. Teneur en protéines est censée être plus élevé quand l’écrevisse est plus proche de la mue que dans la mue entre état18.

2. enregistrement de l’activité cardiaque écrevisses et le comportement

  1. Pour mesurer les fréquences cardiaques écrevisses non-invasive, préalablement préparer le capteur pour cette procédure. Avant cela, mettre une écrevisse dans le réservoir avec de l’eau et laissez-le s’acclimater là pendant quelques jours, comme la préparation de la sonde19 aura également quelques jours.
    1. Couple axialement une IR diode électroluminescente (LED) avec un phototransistor. Fixez le circuit capteur optique sur une planche ; Il faudra une alimentation de 5V. Pour le raccordement de LED, placer une résistance de 200 Ω sur la carte de capteur IR ; afin de connecter le phototransistor, placer une résistance de 220 Ω sur la carte.
    2. Lorsqu’il est attaché à l’écrevisse, la sortie du capteur est modulée par le montant de l’hémolymphe remplissant le muscle cardiaque de l’écrevisse et diffuse une lumière incidente de la LED. Afin d’éviter des interférences réciproques de l’IR lumineux lumière de la LED et le réfléchi IR lumière du cœur d’écrevisses, qui est reçue par le phototransistor, placez un petit mur (0,5 x 1,5 x 4 mm, épaisseur x hauteur x largeur) en plastique antistatique noir entre le LED et le phototransistor.
    3. Placer le LED dans un boîtier étanche et couvrir la surface du capteur avec le gel diélectrique imperméable à l’eau du côté adjacent à la carapace pour la protection des composants électroniques contre les dommages éventuels (Figure 1). Laisser le gel sécher pendant 3 jours afin d’obtenir ses meilleures qualités protectrices.
    4. Pour un signal analogique, fixez les câbles flexibles minces (environ 3 m de long) sur le capteur et se connecter au convertisseur analogique / numérique (ADC) ; sur cette base, un signal numérisé est transféré à un ordinateur personnel via une interface USB, à qui indiquent les informations sur l’écrevisse l’activité cardiaque est enregistrée, analysée dans en temps réel avec un logiciel spécial (voir Table des matières) et stockées pour analyses plus détaillées.
  2. Dès que le capteur est disposé, attachez-le à l’écrevisse. Pour ce faire, lancez l’ordinateur et lancez le logiciel. Déterminer le nombre d’écrevisses à fixer pour les capteurs et la fréquence cardiaque enregistré à être enregistrés dans le fichier date.
  3. Retirer les écrevisses de l’eau et essuyez le côté carapace dorsale avec une serviette en papier. Envelopper les pinces et l’abdomen de l’écrevisse dans la serviette en papier afin d’éviter des dommages par la main de l’homme et pour éliminer le stress supplémentaire sur l’écrevisse causée par des mains humaines chaleureuses.
    Remarque : N’utilisez pas un refroidissement précédent de l’écrevisse sur la glace ou dans le congélateur pendant son immobilisation avant manipulations avec la fixation du capteur. La différence de température conduit à écrevisses dorsal surface pleurs qui, à son tour, conduit à la fixation de capteur peu fiable et rapide détachement adhésive de la carapace de l’écrevisse.
  4. Préparer une surface (c'est-à-dire, prendre un petit morceau de plat de plastique ou déchirer un morceau de ruban adhésif et fixer sur une table) et un bâton pour mélanger la colle. Appuyez sur les deux petites gouttes (d’un diamètre d’environ 0,5 cm) de tubes A et B contenant époxy colle et mélanger rapidement.
  5. Fixez le capteur sur la carapace dorsale d’écrevisses et essayer de trouver l’endroit où l’amplitude du signal cardiaque serait maximale. Tenir l’écrevisse avec la sonde dans une main et, à l’aide de l’autre main libre, mettez une goutte de colle mixte sur chacun des quatre fils auxiliaires situés sur le capteur (fixez-les entre étapes 2.1.1 et 2.1.4.). Ne déplacez pas le capteur au moins 5 min jusqu'à ce que la colle durcisse (le durcissement de la colle dépend de la température ambiante et l’humidité).
    Remarque : Lors de la fixation du capteur à la carapace des écrevisses, examiner soigneusement la zone entière cardiaque du côté carapace afin de définir la zone avec la meilleure amplitude signal cardiaque (maximal). Cela aidera le logiciel pour fournir des calculs plus précis de fréquence cardiaque.
  6. Toucher de la colle à l’aide d’une main de libre et si ce n’est pas collant, mettre l’écrevisse déballé avec le capteur ci-joint (Figure 2) à la boîte sans eau pendant quelques minutes supplémentaires jusqu'à ce que la colle soit complètement sèche.
    Remarque : Une température optimale pour la manipulation d’écrevisses et colle varie de 18 à 22 ° C. À ces températures, la colle durcit pendant 5 à 7 min et est complètement sec dans les 8 à 10 min. À des températures plus basses, le stress chez l’écrevisse est moins prononcé ; Cependant, la colle nécessite plus de temps à durcir, min environ de 15 à 20 sous 15 ° C et 10 ° C, respectivement. Aux températures élevées, en particulier au-dessus de 25 ° C, la colle durcit pendant 3 min, mais l’écrevisse subit beaucoup plus de stress ; par conséquent, essayez de réduire au minimum l’exposition du crustacé aux conditions extrêmes sans eau.
  7. Avant de revenir les écrevisses dans le réservoir, tremper son céphalothorax dans l’eau plusieurs fois avec des intervalles courts de quelques secondes afin de permettre une évacuation de l’air qui s’est accumulée dans les branchies, et laisser les écrevisses dans l’eau pour environ 1 h pour enlever l’excès à tout produit chimique. Une fois ce processus terminé, libère les écrevisses dans l’eau et laissez-la s’acclimater pendant une à deux semaines dans des conditions expérimentales, selon les indices physiologiques observées. L’échange d’eau optimal pendant les périodes d’acclimatation est tous les deux jours.
    Remarque : Caractéristiques d’écrevisses qui ont acclimaté et sont en bon état incluent cardiaque rythme circadien prononcé et activités locomotrices, consommation alimentaire régulière et dépenses plus avancée dans un refuge spécialisé (le cas échéant).

3. appareil photo et le logiciel de configuration

  1. Démarrez le logiciel ; la caméra vidéo allumera automatiquement.
  2. Sélectionnez une option de détection de mouvement, bien détecter zone de chaque citerne à l’écran et le logiciel va commencer suivi le comportement et l’articulation avec les enregistrements de l’activité cardiaque.
    Remarque : Un module de détection de mouvement écrevisses se compose d’une caméra vidéo qui suit le comportement des écrevisses en bas de la cuve et le logiciel qui associe le comportement de l’activité cardiaque. Les données du module sont utilisées pour faciliter le traitement des données plus précise l’activité cardiaque en éliminant les périodes dans lesquelles l’écrevisse montre haute activité locomotive. Mouvements d’écrevisses soudaine (c.-à-d., une réaction de fuite ou d’alimentation initiation) peuvent entraîner des fluctuations ou des pics de courte durée dans des signaux cardiaques pouvant réduire la précision des calculs de l’intervalle cardiaque.

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Representative Results

En conséquence, nous avons obtenu une combinaison d’écrevisses activités cardiaques et comportementales, enregistré et sauvegardé dans un fichier au format txt (Figure 3). Outre le nombre d’écrevisses expérimentales, la date et la fréquence d’échantillonnage, le fichier se compose de trois colonnes : (1) le temps continu au format HH : mm : ; (2) la fréquence cardiaque calculée automatiquement en battements par minute ; (3) la locomotion inscrit comme absence (0) ou (1) la présence de tout mouvement. Quand l’écrevisse était inactif, zéro a été attribuée à la cellule responsable du mouvement, et lorsqu’il est déplacé, alors numéro un est apparu dans la cellule respective. Lors de l’enregistrement en continu, le fichier de données a été créé automatiquement chaque jour à 00 h 00 (12 h 00). Il était essentiel d’inclure la locomotion puisqu’il aurait pu causer des changements dans la fréquence cardiaque (Figure 4). Après 10 s, une odeur de nourriture (larves de chironomidés blanchis, filtrés et dilués) a été livrée dans le réservoir contenant l’écrevisse, à l’aide d’une pompe péristaltique. À 14 s, l’écrevisse reconnu le stimulus et son pouls a légèrement diminué en raison de la réponse d’orientation ce que l'on appelle. Après 20 s, la fréquence cardiaque augmentée, ce qui entraîne une diminution des intervalles cardiaques. À 26 s, l’écrevisse déplacé vers la source de stimulation, et les deux l’excitation physiologique provoquée par l’odeur de la nourriture et l’initiation de la locomotion a entraîné une augmentation substantielle de fréquence cardiaque. À 37 s, il y avait également des mouvements brusques d’écrevisses. En outre, locomotion pourrait ont considérablement contribué à la croissance de la fréquence cardiaque lors des réactions de l’écrevisse à certains stimuli (Figure 5). Une écrevisse perturbée a généralement une augmentation dans la fréquence cardiaque, comme on le voit pendant l’intervalle de 30 – 40 min locomotion occasionnel. Cependant, au cours de l’intervalle de 45 à 50 min, la locomotion est beaucoup plus prononcée. La locomotion a contribué à une fréquence cardiaque qui est significativement plus élevée que celle observée pendant la période de locomotion réduite. Si les données du fichier sont transférées à une autre application ou l’algorithme de programmation ci-dessus est utilisée, les données contenant seulement l’activité cardiaque de l’écrevisse pourraient être obtenues et traitées si nécessaire (Figure 6). La fréquence cardiaque d’écrevisses non perturbés est caractérisée par une amplitude monotone de la courbe du rythme cardiaque et par à peu près égales cardiaques intervalles entre chaque pic cardiaque.

Afin d’analyser les modèles de comportement d’écrevisses (distance tels que passé, préférence d’un certain secteur de la vélocité de réservoir ou arena et locomotion), il serait possible d’échanger l’appareil actuel avec une caméra vidéo standard avec un angle plat, comme le appareil photo utilisé actuellement ne fait pas un enregistrement mais juste titres locomotion. Par ailleurs, un enregistrement avec n’importe lequel des applications en ligne pour la capture d’une vidéo de l’écran pourrait être utilisé.

Figure 1
Figure 1 : Capteur non invasif optoélectronique infrarouge. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Signal d’écrevisses, Pacifastacus leniusculus, maintenant le capteur sur sa carapace. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Un exemple du fichier de données. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Pulsation écrevisses lors du changement de normal à perturbé conditions lorsqu’il est exposé à des odeurs de nourriture. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Fréquence cardiaque et les activités de la locomotion de l’écrevisse en non perturbés (0 – 30 min) et des conditions perturbées (30 à 60 min). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Fréquence cardiaque non perturbée écrevisses. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Il a été largement suggéré que la mesure de certains paramètres physiologiques (comme le cœur ou le débit de ventilation ou les deux) est une méthode plus fiable pour l’enregistrement des réactions d’écrevisses que l’évaluation des réponses comportementales qui n’existent pas toujours immédiatement11. Cependant, il est évident que l’approche la plus efficace pour évaluer les réactions des écrevisses réel aux changements environnementaux étant donné la combinaison de l’activité cardiaque et enregistrements de comportement qui permet de voir l’ou les raisons pour la pulsation de l’écrevisse changements et si oui ou non ils se produisent à la suite des modifications chimiques dans l’environnement ambiant ou en raison de l’ouverture de la locomotion. Au cours de la surveillance de qualité de l’eau, il est essentiel d’éliminer toutes les influences extérieures sur les changements dans les indicateurs physiologiques écrevisses, y compris les mouvements brusques qui ont des effets sur la fréquence cardiaque accrues, mais ne présentent pas une alarme pour le système de biosurveillance.

Une autre possibilité pour faciliter une évaluation du rythme cardiaque plus précis et informatifs sont les analyses inotrope paramètre d’écrevisses activités cardiaques liées principalement à des formes spécifiques à l’écrevisse des signaux cardiaques19et chronotropes. Ces analyses confirment que même lorsque les battements du cœur changé seulement quelques battements par minute, certains des paramètres secondaires sont révélateurs des changements significatifs à l’écrevisse activités cardiaques19.

Malgré le nombre d’avantages dans l’utilisation de l’approche décrite, recherche autour de suivi d’écrevisses a déménagé vers une réduction absolue de manipulations tactiles écrevisses. Dans le système sans contact récemment développé20, l’élimination des capteurs et leurs fils correspondants signifie qu’écrevisses de toute taille peuvent être utilisés pour la procédure de suivi. Il est également possible de conserver plusieurs écrevisses dans un domaine expérimental puisque l’absence de fils empêche les fils de s’emmêler et de restrictions de déplacement d’écrevisses. L’écrevisse transportera juste deux petits morceaux d’une bande très réfléchissante qui indique sa zone cardiaque. Ces morceaux de ruban peut être attaché à l’écrevisse même après après la mue quelques jours. Activités cardiaques les écrevisses et les comportements sont enregistrées par la caméra vidéo et analysées en temps réel par le logiciel de coordination. Ainsi que d’autres progrès techniques, la méthode modifiée entraînera une baisse significative du prix du système de surveillance en raison matérielle limitée.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Cette étude a été financée par le ministère de l’éducation, de jeunesse et de Sports de la République tchèque-projets « CENAKVA » n° CZ.1.05/2.1.00/01.0024 et no « CENAKVA II'' LO1205 sous la durabilité National programme I, par l’agence de Grant de l’Université de Bohême du Sud, en České Budějovice (012/2016/Z) et par l’agence de la subvention de la République tchèque (n ° 16-06498S)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IR LED diode KINGBRIGHT ELECTRONIC KP-3216F3C
Phototransistor EVERLIGHT ELPT15-21C
Resistor ROYAL OHM 0805S8J0201T5E
Resistor ROYAL OHM 0805S8F2200T5E
Capacitor KEMET C0805C334K5RACTU
Cable TECHNOKABEL FTP KAT.5E 4X2X0,14C
Connector HARTING 21348100380005
Connector HARTING 21348000380005
Dielectric gel KRAYDEN Sylgard 535
Analogue-to-digital convertor TEDIA UDAQ-1416CA
Glue KUPSITO.SK 7338723044
Kinect video camera ABCSTORE.CZ GT3-00002
Analysis software University of South Bohemia in Ceske Budejovice, Faculty of Fisheries and Protection of Waters, Institute of Complex Systems Link to the software: www.frov.jcu.cz/crayfishmonitoring
User name: frov
Password: CF2018

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