Studera neurobeteendeeffekter av miljöföroreningar på zebrafisk larver

Environment

Your institution must subscribe to JoVE's Environment section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Ett detaljerat experimentellt protokoll presenteras i detta dokument för utvärdering av neurobeteendetoxicitet av miljöföroreningar med hjälp av en zebrafisklarver modell, inklusive exponeringsprocessen och tester för neurobehavioral indikatorer.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Zhang, B., Yang, X., Zhao, J., Xu, T., Yin, D. Studying Neurobehavioral Effects of Environmental Pollutants on Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (156), e60818, doi:10.3791/60818 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

De senaste åren har allt fler miljöföroreningar visat sig vara neurotoxiska, särskilt i de tidiga utvecklingsstadierna av organismer. Zebrafisklarver är en framstående modell för neurobeteendestudien av miljöföroreningar. Här tillhandahålls ett detaljerat experimentellt protokoll för utvärdering av neurotoxicitet en miljöförorening med zebrafisklarver, inklusive insamling av embryon, exponeringsprocessen, neurobeteendeindikatorer, testprocessen och dataanalys. Dessutom diskuteras kulturmiljön, exponeringsprocessen och experimentella förhållanden för att säkerställa analysens framgång. Protokollet har använts i utvecklingen av psykopatiska läkemedel, forskning om miljöneurotoxiska föroreningar, och kan optimeras för att göra motsvarande studier eller vara till hjälp för mekanistiska studier. Protokollet visar en tydlig operation process för att studera neurobehavioral effekter på zebrafisk larver och kan avslöja effekterna av olika neurotoxiska ämnen eller föroreningar.

Introduction

Under de senaste åren har fler och fler miljöföroreningar visat sig vara neurotoxiska1,2,3,4. Bedömningen av neurotoxicitet in vivo efter exponering för miljöföroreningar är dock inte lika lätt som endokrina störningar eller utvecklingstoxicitet. Dessutom har tidig exponering för föroreningar, särskilt vid miljörelevanta doser, rönt ökad uppmärksamhet i toxicitetsstudier5,6,7,8.

Zebrafisk håller på att etableras som en djurmodell som är lämplig för neurotoxicitetsstudier under tidig utveckling efter exponering för miljöföroreningar. Zebrafisk är ryggradsdjur som utvecklas snabbare än andra arter efter befruktning. Larverna behöver inte matas eftersom näringsämnena i chorion är tillräckligt för att upprätthålla dem i 7 dagar postfertilisering (dpf)9. Larver kommer ut från chorion på ~ 2 dpf och utveckla beteenden som simning och svarvning som kan observeras, spåras, kvantifieras och analyseras automatiskt med hjälp av beteendeinstrument10,11,12,13 börjar vid 3-4 dpf14,15,16,17,18. Dessutom kan tester med hög genomströmning också realiseras genom beteendeinstrument. Således zebrafisk larver är en enastående modell för neurobehavioral studie av miljöföroreningar19. Här erbjuds ett protokoll med hjälp av övervakning med hög genomströmning för att studera den neurobeteendemässiga toxiciteten hos miljöföroreningar på zebrafisklarver under ljusstimuli.

Vårt labb har studerat neurobeteendetoxiciteten hos 2,2',4,4'-tetrabromdifenyleter (BDE-47)20,21, 6'-Hydroxi/Metoxi-2,2',4,4'-tetrabromdifenyletrer (6-OH/MeO-BDE-47)22, deca-bromerad difenyleter (BDE-209), bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly och kommersiella klorerade paraffiner23 med det protokoll som presenteras. Många laboratorier använder också protokollet för att studera de neurobehavioral effekterna av andra föroreningar på larver eller vuxna fiskar24,25,26,27. Detta neurobehavioral protokoll användes för att ge mekanistiskt stöd som visar att låg dos exponering för bisfenol A och ersättning bisfenol S inducerad för tidig hypothalamic neurogenesis i embryonal zebrafisk27. Dessutom optimerade vissa forskare protokollet för att utföra motsvarande studier. En nyligen genomförd studie eliminerade toxiciteten av amyloid beta (Aβ) i en enkel, hög genomströmning zebrafisk modell med kaseinbelagda guld nanopartiklar (βCas AuNPs). Det visade att βCas AuNPs i systemisk cirkulation flyttade över blod - hjärnbarriären av zebrafisk larver och beslagtagna intracerebrala Aβ42, framkalla toxicitet på ett ospecifikt, förkläde-liknande sätt, som stöddes av beteendemässiga patologi28.

Förflyttning, banvinkel och social aktivitet är tre neurobeteendeindikatorer som används för att studera neurotoxicitetseffekterna av zebrafisklarver efter exponering för föroreningar i det presenterade protokollet. Locomotion mäts av larvernas badavstånd och kan skadas efter exponering för föroreningar. Banvinkel och social aktivitet är närmare besläktade med hjärnans funktion och centrala nervsystemet29. Banvinkeln avser vinkeln på djurrörelsernas bana i förhållande tillsimriktningen 30. Åtta vinkelklasser från ~-180°-~+180° är inställda i systemet. För att förenkla jämförelsen definieras sex klasser i slutresultatet som rutinsvängar (-10° ~0°, 0° ~+10°), genomsnittliga varv (-10° ~-90°, +10° ~+90°) och responsiva svängar (-180° ~-90°, +90° ~+180°) enligt våra tidigare studier21,22. Tvåfiskars social aktivitet är grundläggande för grupps shoaling beteende; här definieras ett distansera av < 0.5 cm mellan två larver som är giltiga som social kontakt.

Protokollet presenteras här visar en tydlig process för att studera neurobehavioral effekter på zebrafisk larver och ger ett sätt att avslöja neurotoxicitet effekterna av olika ämnen eller föroreningar. Protokollet kommer att gynna forskare som är intresserade av att studera neurotoxicitet av miljöföroreningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokollet är i enlighet med riktlinjer som godkänts av Zoo Ethics Committee of Tongji University.

1. Insamling av zebrafiskembryon

  1. Sätt två par friska vuxna Tubingen zebrafisk i leklådan på natten före exponering, hålla kön förhållandet på 1:1.
  2. Ta bort den vuxna fisken tillbaka till systemet 30-60 min efter dagsljus nästa morgon.
  3. Ta bort embryona ur leklådan.
  4. Skölj embryona med systemvatten.
  5. Överför embryona till en petriskål i glas (9 cm diameter) med tillräckligt med systemvatten.
  6. Observera embryona under mikroskopet och välj friska embryon för senare exponering.
    OBS: Friska embryon är oftast transparenta med ljus gyllene färg under mikroskopet. De ohälsosamma embryona är vanligtvis bleka och klumpade ihop sig enligt mikroskopet.

2. Beredning före exponering

  1. Förbered Hanks lösning enligt riktlinjerna i zebrafiskboken31.
    OBS: Hanks lösning innehåller 0,137 M NaCl, 5,4 mM KCl, 0,25 mM Na2HPO4, 0,44 mM KH2PO4, 1,3 mM CaCl2, 1,0 mM MgSO4och 4,2 mM NaHCO3.
  2. Späd Hanks lösning på 10% Hanks lösning med sterilt vatten.
  3. Lägg till 1 ml DMSO i 999 ml 10% Hanks lösning för att göra en kontrolllösning på 10% Hanks lösning inklusive 0,1% DMSO.
    I nästa steg används BDE-47 som ett exempel på en exponeringslösning.
  4. Lös 5 mg av den prydliga BDE-47 i 1 ml 100% DMSO för att göra en standardexponeringslösning på 5 mg/ml.
  5. Virvel 5 mg/ml-lösningen i 1 min för att helt lösa upp BDE-47 i DMSO.
  6. Överför 10 μL av 5 mg/ml-lösningen till en 12 ml brun glasflaska.
  7. Tillsätt steriliserat vatten till en slutlig volym på 10 ml för att göra koncentrationen av BDE-47 exponeringslösning 5 mg/L och DMSO-förhållande på 0,1%, sedan virvel i 1 min.
  8. Överför 10 μL och 100 μL av 5 mg/L-lösningen till två 100 ml mätkolvar.
  9. Tillsätt 10 % Hanks lösning inklusive 0,1 % DMSO (beredd i steg 2.3) till 100 ml för att göra de slutliga koncentrationerna av BDE-47-exponeringslösningarna 5 μg/L respektive 50 μg/L.
  10. Överför lösningarna till 100 ml bruna glasflaskor och förvara dem vid 4 °C.

3. Embryonas exponering

  1. Överför ~ 50 embryon till var och en av de tre glas Petri rätter (6 cm diameter) 3-5 timmar efter befruktning (HPF).
  2. Använd en 1 mL pipett spets för att utplåna systemet vatten runt embryona.
  3. Använd en pipett för att överföra kontroll- och två BDE-47-exponeringslösningar (kontroll, 5 μg/L, 50 μg/L) till de tre glaspetrirätterna.
  4. Skaka glaset Petrirätter försiktigt en efter en för att få embryona att skingra sig i botten av plattan.
  5. Lägg glaspetrirätterna i ljusinkubatorn under 28,5 °C.
  6. Förnya hälften av exponeringslösningarna var 24:e timme till 5 dpf.
  7. Kontrollera de döda embryona i varje grupp på 1 dpf och 2 dpf och beräkna dödligheten.
  8. Kontrollera de inkubera embryona i varje grupp på 2 dpf och 3 dpf och beräkna kläckeriliteten.
  9. Kontrollera larvernas deformitet varje dag efter att de kommer ut från chorion och beräkna deformitetsgraden för varje grupp.
    OBS: Deformitetindikatorerna inkluderar perikardvätska potatiscystnematod, spinal krökning, svanskrökning, bland annat faktorer32.

4. Förberedelser för beteendetestet

  1. Förbered en 48 brunnsmikroplatta för förflyttnings- och banvinkeltestet och tre 6 brunnsmikroplattor för testet av social aktivitet på morgonen 5 dpf.
  2. Överför 800 μL exponeringslösning till varje brunn av den 48 brunns mikroplattan.
    OBS: Använd 16 brunnar för varje grupp (dvs. styrlösningen, 5 μg/L och 50 μg/L-grupp).
  3. Använd en 1 mL pipettspets för att överföra 200 μl exponeringslösning med en larvfrån glaspetriskålen till en brunn av den 48 brunns mikroplatta.
  4. Överför 4 ml exponeringslösning till varje brunn av 6 brunnen sett.
    Obs!
  5. Använd en 1 mL pipettspets för att överföra 200 μl exponeringslösning med två larver i varje brunn av den 6 brunns mikroplatta.
    Varje grupp har sex upprepande grupper.
  6. Kontrollera att temperaturen på provrummet är 28 °C 2 timmar före provningen.
    OBS: Beteendetester utförs vanligtvis på eftermiddagen.

5. Beteendetest

  1. Locomotion och banvinkeltest
    1. Klicka på startikonen på datorskrivbordet för att öppna programvaran (se Materialförteckning)som styr höggenomströmningsövervakningshöljet för att starta programmet.
    2. Välj modulen "Spårning, Rotationer, Banvinklar" för att ange driftgränssnittet.
    3. Överför den 48 brunnsmikroplatta som förbereddes i steg 4.3 till inspelningsplattformen och dra ner locket.
    4. Klicka på knappen "File" "Generate Protocol" i sin tur i programvaran för att börja generera ett nytt protokoll.
    5. Mata in "48" i positionen "Platsantal" och klicka på knappen "OK".
    6. Klicka på knappen "Parametrar" "Protokollparametrar" "Time" i sin tur i programvaran. Ställ in experimenttiden i 1 h och 10 min och ställ in integrationsperioden till 60 s33.
    7. Rita de upptäckta områdena.
      1. Markera den elliptiska formen och rita den första cirkeln runt den första övre vänstra brunnen.
      2. Markera cirkeln, klicka på knappen "Kopiera" "Övre högra mark" ""Välj" " i sin tur och använd musen för att dra den kopierade cirkeln längst upp till höger.
      3. Markera cirkeln, klicka på knappen "Kopiera" "Nedersta markering""" Välj" i sin tur och använd musen för att dra den kopierade cirkeln längst ned till höger.
      4. Klicka på knappen "Bygg"" Rensa markeringar" i sin tur.
        SYSTEMET drar automatiskt varannan brunn av plattan. De nyskapade områdena bör passa perfekt varje brunn mellan den faktiska fisken och dess reflektion på sidan av brunnen.
    8. Klicka på knappen "Rita skala", rita en kalibreringslinje på skärmen (en diagonal bana eller parallell till sidan av mikroplattan), ange dess längd och ställ in "Enheten". Klicka sedan på knappen "Använd för grupp".
    9. Ställ in djurfärgen på "Black" i programvaran.
    10. Ställ in detektionströskeln till 16-18 så att djuren upptäcks.
    11. Ingång inaktiv/liten och liten/stor hastighet med 0,5 cm/s respektive 2,5 cm/s.
    12. Ange banvinkelklasserna. Ingång "-90, -30, -10, 0, 10, 30 och 90" för att göra banvinkelklasser från -180°-+180°.
    13. Ställ in ljusförhållanden
      1. Klicka på knappen "Parametrar" "Light driving" "Använder en av de 3 utlösande metoderna nedan" " Enhancedstimuli" i sin tur för att ställa in ljusförhållandena.
      2. Välj knappen "Edge" och ställ sedan in en mörk period på 10 min, följt av tre växlare 10 min ljusa och mörka perioder.
    14. Spara protokollet och skruva ner testrummets ljus.
    15. Acklimatisera larverna i systemet i 10 min och klicka på knappen "Experiment" "Kör" i sin tur och välj sedan mappen där experimentfilerna sparas och ange resultatnamnet.
    16. Klicka på knappen "Bakgrund" "Start" i sin tur för att starta testet.
    17. Klicka på knappen "Experiment" "Stop" i sin tur för att stoppa experimentet när testet avslutas.
      Systemet visar de data som testas när systemet stannar. Uppgifterna omfattar det spårade avståndet vid tre hastighetsklasser och banvinkelnummer vid åtta vinkelklasser varje minut. För förflyttningstestet i det presenterade exemplet beräknas det totala avståndet under varje ljusperiod (10 min) och skillnaden mellan kontrollgruppen och behandlingsgrupperna jämförs.
    18. Överför 48 brunnsmikroplattan tillbaka till ljusinkubatorn för andra experiment.
  2. Test av social aktivitet
    1. Klicka på ikonen på startikonen på datordisken för att öppna programvaran som styr hög genomströmningsövervakningshöljet för att starta programmet.
    2. Välj modulen "Sociala interaktioner" för att komma in i driftgränssnittet.
    3. Överför den förberedda 6 brunnsmikroplattan (kontrollgruppen) i steg 4.4 till inspelningsplattformen och dra ner locket.
    4. Klicka på knappen "File" "Generate Protocol" i sin tur i programvaran för att börja generera ett nytt protokoll.
    5. Mata in "6" i positionen "Platsantal" och klicka på knappen "OK".
    6. Klicka på knappen "Parametrar" "Protokollparametrar" "Time" i sin tur i programvaran. Ställ in experimenttiden i 1 h och 10 min och ställ in integrationsperioden till 60 s.
    7. Rita de upptäckta områdena.
      1. Markera den elliptiska formen och rita den första cirkeln runt den första övre vänstra brunnen.
      2. Markera cirkeln, klicka på knappen "Kopiera" "Övre högra mark" ""Välj" " i sin tur och använd musen för att dra den kopierade cirkeln till den övre högra brunnen.
      3. Markera cirkeln, klicka på knappen "Kopiera" "Nedersta markering""" Välj" i sin tur och använd musen för att dra den kopierade cirkeln längst ned till höger.
      4. Klicka på knappen "Bygg"" Rensa markeringar" i sin tur.
        OBS: De nyskapade områdena bör passa varje väl perfekt och mellan de faktiska larverna och dess reflektion på sidan av brunnen.
    8. Klicka på knappen "Rita skala", rita en kalibreringslinje på skärmen (en diagonal bana eller parallell till sidan av mikroplattan), ange dess längd och ställ in "Enheten". Klicka sedan på knappen "Använd för grupp".
    9. Ställ in detektionströskeln till 16-18 så att djuren upptäcks.
    10. Klicka på knappen "Svart djur" i programvaran.
    11. Välj knappen "Avståndströskel" och mata in "5" i programvaran.
    12. Ställ in ljusförhållandena.
      1. Klicka på knappen "Parametrar" "Light driving" "Använder en av de 3 utlösande metoderna nedan" " Enhancedstimuli" i sin tur för att ställa in ljusförhållandena.
      2. Välj knappen "Edge" och ställ sedan in en mörk period på 10 min, följt av tre växlare 10 min ljusa och mörka perioder.
    13. Spara protokollet och skruva ner ljuset i rummet.
    14. Acklimatisera larverna i systemet i 10 min och klicka på knappen "Experiment" "Kör" i sin tur och välj sedan mappen där experimentfilerna sparas och ange resultatnamnet.
    15. Klicka på knappen "Bakgrund" "Start" i sin tur för att starta testet.
    16. Klicka på knappen "Experiment" "Stop" i sin tur för att stoppa experimentet i programvaran när testet avslutas.
      Systemet visar de data som testas när systemet stannar.
    17. Överför 6 brunnsmikroplattan (kontrollgrupp) tillbaka till ljusinkubatorn för andra experiment.
    18. Överför de 6 brunnsmikroplattorna (5 μg/L och 50 μg/L-grupper) i sin tur till inspelningsplattformen och upprepa stegen från 5.2.4 till 5.2.17 med ordinal.

6. Dataanalys

  1. Öppna kalkylbladsfilen i locomotion- och banvinkelresultaten.
  2. Välj de tre avståndskolumnerna (inadist, smldist, lardist) och lägg till dem.
    OBS: Uppgifterna om inadist, smldistoch ister betyder olika avstånd som registrerats av systemet i olika hastighetsklasser (inaktiva/små/stora), respektive.
  3. För varje 10 minuters ljusperiod summera avståndet för varje brunn, beräkna det genomsnittliga avståndet på 16 brunnar och jämför data från de tre grupperna under ljusstimuli.
  4. För varje 10 minuters ljusperiod summera vinkelnumret för varje brunn under varje ljusvaraktighet från cl01 till cl08 i sin tur, och jämför uppgifterna för de tre grupperna under lätta stimuli.
    Data från cl01 till cl08 avser olika sökvägsvinkelnummer som registreras av systemet i olika banvinklar.
  5. Öppna kalkylbladsfilen i resultaten av den sociala aktiviteten.
  6. Välj de contct och contdur kolumner, och för varje 10 min ljusperiod sammanfatta de sociala tiderna och deras varaktighet för varje brunn.
  7. Beräkna den genomsnittliga sociala tider och varaktighet en grupp under varje ljusvaraktighet och jämför data för de tre grupperna under ljusstimuli.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Här beskriver vi ett protokoll för att studera de neurobeteendemässiga effekterna av miljöföroreningar med zebrafisklarver under lätta stimuli. Förflyttning, banvinkel och sociala aktivitetstester definieras i inledningen. Installationen av mikroplattorna i förflyttnings- och banvinkeltesterna och bilderna av programvaran visas nedan. Dessutom presenteras våra egna forskningsresultat som exempel. Två studier presenterar förflyttnings- och banvinkeleffekterna efter exponering för BDE-47 och 6-OH/MeO-BDE-47. Den tredje studien presenterar effekterna av fyra kommersiella klorerade paraffiner på socialt beteende.

Installationen av den 48 brunnmikroplåt en och larvernas rörelselocus i förflyttnings- och banvinkeltestet.
Tre grupper, inklusive en kontrollgrupp och två behandlingsgrupper, användes i protokollet. Eftersom varje grupp kan ha 16 djur kan systemet användas för att utföra tester med hög genomströmning av förflyttning och banvinkel i en mikroplatta. Figur 1 visar en larv som behandlas med styrlösningen, 5 μg/L-lösning och 50 μg/l-lösning i varje brunn av de första, mellersta respektive sista två raderna.

Figur 1 visar också alla rörelseloci av larverna i förflyttnings- och banvinkeltesterna. Systemet spårade larvernas rörelse och beräknade badavståndet vid olika hastighetsklasser. Systemet beräknade banvinkelnumren för larver vid olika banvinkelklasser. Forskare kan analysera de data som registreras av systemet på sitt eget sätt.

Figure 1
Figur 1: Inställning av den 48 brunnsmikroplatta och larvernas rörelseloci i locomotion- och banvinkeltestet. A1-A8, B1-B8 = kontrollgruppen; C1-C8, D1-D8 = gruppen 5 μg/L; E1-E8, F1-F8 = gruppen 50 μg/L. Den svarta färgspårningslinjen betyder inaktivitet eller små rörelser. den gröna färgspårningslinjen betyder normala rörelser; och den röda färgspårningslinjen innebär stora rörelser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Den 6 brunnsmikroplattan i testet av social aktivitet.
Figur 2 visar en 6 brunns mikroplatta i testprocessen för social aktivitet. Varje brunn hade två larver, och systemet spelade in avståndet mellan de två larverna under hela testprocessen. Systemet registrerade talen för social aktivitet och varaktighet under den inställda testtiden (1 min i detta protokoll).

Figure 2
Figur 2: Den 6 brunnsmikroplatta i testet för social aktivitet. Varje brunn hade två larver. Den gula linjen betyder att avståndet mellan två djur är < 0,5 cm; den röda linjen innebär att avståndet mellan två djur är > 0,5 cm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

BDE-47 exponering påverkade rörelse i zebrafisklarver vid 5 dpf.
Som framgår av figur 3producerade den högsta koncentrationsgruppen Av BDE-47 uttalad hypoaktivitet under den mörka perioden. Det fanns dock inga observerade förändringar på grund av exponering en BDE-47 under ljusperioderna.

Figure 3
Figur 3: Effekterna av BDE-47-exponering en rörelse vid förflyttning av larvalzebrafisk vid 5 dpf. Locomotion (avstånd som flyttades mätt i cm) spelades in i omväxlande perioder av mörker och ljus under en total varaktighet på 70 min. Fasta och öppna stänger i botten indikerar mörka respektive ljusa perioder. Uppgifterna presenteras som medelvärde ± SEM (*p < 0,05 jämfört med kontrollgruppen). Denna siffra har ändrats från Zhao et al.17 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

6-OH/MeO-BDE-47 exponering påverkade sökvägen vinklar zebrafisk larver vid 5 dpf.
Som framgår av figur 4utförde högkoncentrationsgruppen med 6-OH-BDE-47 färre rutinsvängar och snittvarv vid 5 dpf. Men mer lyhörda svängar framkallades av 6-MeO-BDE-47 exponeringsgrupper.

Figure 4
Figur 4: Effekterna av 6-OH/MeO-BDE-47 på gärningsvinkeln hos larvalzebrafisk under den mörka perioden. Uppgifterna presenteras som medelvärde ± SEM (*p < 0,05 jämfört med kontroll). Denna siffra har ändrats från Zhang et al.18 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

CPs exponering påverkade social aktivitet zebrafisk larver vid 5 dpf.
Som framgår av figur 5påverkades zebrafisklarvernas sociala beteenden av tre CP-produkter. Den sociala aktiviteten stimulerades av CP-70 och den kortkedjade CP-52b. Den långa kedjan CP-52a förkortade larvernas varaktighet per kontakt.

Figure 5
Figur 5: CPs effekter på den genomsnittliga sociala varaktigheten per kontakt under olika ljus/mörka perioder. ACP-42,bCP-52a, (C) CP-52b,D) CP-70. Uppgifterna presenteras som medelvärde ± SEM (*p < 0,05 jämfört med kontrollen). Denna siffra har ändrats från Yang et al.19 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta arbete ger ett detaljerat experimentellt protokoll för att utvärdera neurotoxiciteten hos miljöföroreningar med zebrafisklarver. Zebrafisk går igenom processen från embryon till larver under exponeringsperioden, vilket innebär att god vård av embryon och larver är viktigt. Allt som påverkar utvecklingen av embryon och larver kan påverka slutresultatet. Här diskuteras kulturmiljön, exponeringsprocessen och experimentella förhållanden för att säkerställa att hela analysen blir framgångsrik.

För kulturmiljön lever zebrafiskembryon och larver under en stabil temperatur på ~28 °C. I detta arbete används en ljusinkubator som kan ställa in ljusförhållandena automatiskt och hålla temperaturen stabil för att hysa embryon och larver. Embryona kommer inte ut från chorion vid 1 dpf och 2 dpf, så försiktighet bör iakttas för att undvika att skada de okläckta embryona när exponeringslösningen förnyas. Förhållandet mellan DMSO i lösningen bör också vara under 0,1 %34,35och den färska exponeringslösningen ska vara 28 °C innan den används för förnyelse.

Processen att välja embryon före exponering är också en viktig faktor för att experimentet ska lyckas. Att välja friska embryon som utvecklas samtidigt för varje grupp garanterar att toxicitetsbedömningen är korrekt. Zebrafisk kan leva utan mat under de första 7 dagarna efter befruktningen, så det är bäst att inte mata embryona eller larverna under hela exponeringsperioden eftersom mat kan påverka slutresultatet. Dessutom är det bäst att förbereda exponeringslösningen färsk när det behövs.

Under beteendetestet är det viktigt att erbjuda larverna tillräckligt med tid för att anpassa sig till miljön i höggenomströmningsövervakningen. Före provningen bör varje steg i det testade protokollet kontrolleras noggrant, inklusive ljustillstånd, provningstid etc. Testrummet ska hållas helt tyst och mörkt för att inte störa djuren.

Protokollet presenteras erbjuder en grundläggande ram för att studera neurobehavioral toxicitet miljöföroreningar. Det finns också andra typer av beteenden som används vid studier av neurobehavioral effekter, såsom färg-preferens tester36, botten bostad tester37, ljus / mörk preferens tester38,39, etc. Dessa tester använder dock huvudsakligen vuxna zebrafiskar, som inte är lämpliga för tester med hög genomströmning. Dessutom, Weichert et al. videofilmade till beteendet hos spontana svans rörelser som kan kvantifieras strax efter 24 h exponering40. Utvärderingen av neurobeteendetoxicitet innehåller också mekanismstudier om hjärnans funktion och centrala nervsystemet. De grundläggande neurobehavioral indikatorerna introduceras här och kan ligga till grund för mer komplexa indikatorer med hjälp av andra beteendeinstrument. I slutändan kan utvecklingen av nya neurobeteendeindikatorer tillsammans med denna studiemekanism användas i framtida studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Författarna är tacksamma för det ekonomiska stödet från National Natural Science Foundation of China (21876135 och 21876136), Kinas nationella stora vetenskaps- och teknikprojekt (2017ZX07502003-03, 2018ZX07701001-22), stiftelsen för MOE-Shanghai Key Laboratory of Children's Environmental Health (CEH201807-5) och Vetenskapsrådet (nr 639-2013-6913).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
48-well-microplate Corning 3548 Embyros housing
6-well-microplate Corning 3471 Embyros housing
BDE-47 AccuStandard 5436-43-1 Pollutant
DMSO Sigma 67-68-5 Cosolvent
Microscope Olympus SZX 16 Observation instrument
Pipette Eppendorf 3120000267 Transfer solution
Zebrabox Viewpoint ZebraBox Behavior instrument
Zebrafish Shanghai FishBio Co., Ltd. Tubingen Zebrafish supplier
ZebraLab Viewpoint ZebraLab Behavior software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sun, L., et al. Developmental neurotoxicity of organophosphate flame retardants in early life stages of Japanese medaka (Oryzias latipes). Environmental Toxicology and Chemistry. 35, (12), 2931-2940 (2016).
  2. Tian, L., et al. Neurotoxicity induced by zinc oxide nanoparticles: age-related differences and interaction. Scientific Reports. 5, 16117 (2015).
  3. Rauh, V. A., Margolis, A. E. Research review: environmental exposures, neurodevelopment, and child mental health-new paradigms for the study of brain and behavioral effects. Journal of Child Psychology and Psychiatry. 57, (7), 775-793 (2016).
  4. Ye, B. S., Leung, A. O. W., Wong, M. H. The association of environmental toxicants and autism spectrum disorders in children. Environmental Pollution. 227, 234-242 (2017).
  5. Schwarzenbach, R. P., Gschwend, P. M., Imboden, D. M. Environmental Organic Chemistry. John Wiley & Sons. (2016).
  6. Akortia, E., et al. A review of sources, levels, and toxicity of polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) and their transformation and transport in various environmental compartments. Environmental Reviews. 24, (3), 253-273 (2016).
  7. Shaw, B. J., Liddle, C. C., Windeatt, K. M., Handy, R. D. A critical evaluation of the fish early-life stage toxicity test for engineered nanomaterials: experimental modifications and recommendations. Archives of Toxicology. 90, (9), 2077-2107 (2016).
  8. Landrigan, P. J., et al. Early environmental origins of neurodegenerative disease in later life. Environmental Health Perspectives. 113, (9), 1230-1233 (2005).
  9. Xu, T., Yin, D. The unlocking neurobehavioral effects of environmental endocrine disrupting chemicals. Current Opinion in Endocrine and Metabolic Research. 7, 9-13 (2019).
  10. Panula, P., et al. Modulatory neurotransmitter systems and behavior: towards zebrafish models of neurodegenerative diseases. Zebrafish. 3, (2), 235-247 (2006).
  11. Félix, L. M., Antunes, L. M., Coimbra, A. M., Valentim, A. M. Behavioral alterations of zebrafish larvae after early embryonic exposure to ketamine. Psychopharmacology. 234, (4), 549-558 (2017).
  12. Bailey, J. M., et al. Persistent behavioral effects following early life exposure to retinoic acid or valproic acid in zebrafish. Neurotoxicology. 52, 23-33 (2016).
  13. Richendrfer, H., Créton, R. Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae. Journal of Visualized Experiments. (77), e50622 (2013).
  14. Best, J. D., Alderton, W. K. Zebrafish: An in vivo model for the study of neurological diseases. Neuropsychiatric Disease & Treatment. 4, (3), 567-576 (2008).
  15. Yuhei, N., et al. Zebrafish as a systems toxicology model for developmental neurotoxicity testing. Congenital Anomalies. 55, (1), 1-16 (2015).
  16. Wu, S., et al. TBBPA induces developmental toxicity, oxidative stress, and apoptosis in embryos and zebrafish larvae (Danio rerio). Environmental Toxicology. 31, (10), 1241-1249 (2016).
  17. Chakraborty, C., Sharma, A. R., Sharma, G., Lee, S. S. Zebrafish: A complete animal model to enumerate the nanoparticle toxicity. Journal of Nanobiotechnology. 14, (1), 65 (2016).
  18. Wehmas, L. C., et al. Comparative metal oxide nanoparticle toxicity using embryonic zebrafish. Toxicology Reports. 2, 702-715 (2015).
  19. Cavalieri, V., Spinelli, G. Environmental epigenetics in zebrafish. Epigenetics & Chromatin. 10, (1), 46 (2017).
  20. Zhang, B., et al. Effects of three different embryonic exposure modes of 2, 2?, 4, 4?-tetrabromodiphenyl ether on the path angle and social activity of zebrafish larvae. Chemosphere. 169, 542-549 (2017).
  21. Zhao, J., Xu, T., Yin, D. Q. Locomotor activity changes on zebrafish larvae with different 2, 2?, 4, 4?-tetrabromodiphenyl ether (PBDE-47) embryonic exposure modes. Chemosphere. 94, 53-61 (2014).
  22. Zhang, B., et al. Neurobehavioral effects of two metabolites of BDE-47 (6-OH-BDE-47 and 6-MeO-BDE-47) on zebrafish larvae. Chemosphere. 200, 30-35 (2018).
  23. Yang, X., et al. The chlorine contents and chain lengths influence the neurobehavioral effects of commercial chlorinated paraffins on zebrafish larvae. Journal of Hazardous Materials. 377, 172-178 (2019).
  24. Schmitt, C., McManus, M., Kumar, N., Awoyemi, O., Crago, J. Comparative analyses of the neurobehavioral, molecular, and enzymatic effects of organophosphates on embryo-larval zebrafish (Danio rerio). Neurotoxicology and Teratology. 73, 67-75 (2019).
  25. Li, X., Kong, H., Ji, X., Gao, Y., Jin, M. Zebrafish behavioral phenomics applied for phenotyping aquatic neurotoxicity induced by lead contaminants of environmentally relevant level. Chemosphere. 224, 445-454 (2019).
  26. Leuthold, D., Klüver, N., Altenburger, R., Busch, W. Can environmentally relevant neuroactive chemicals specifically be detected with the locomotor response test in zebrafish embryos? Environmental Science & Technology. 53, (1), 482-493 (2018).
  27. Kinch, C. D., Ibhazehiebo, K., Jeong, J. H., Habibi, H. R., Kurrasch, D. M. Low-dose exposure to bisphenol A and replacement bisphenol S induces precocious hypothalamic neurogenesis in embryonic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (5), 1475-1480 (2015).
  28. Javed, I., et al. Inhibition of amyloid beta toxicity in zebrafish with a chaperone-gold nanoparticle dual strategy. Nature Communications. 10, (1), 1-14 (2019).
  29. Green, J., et al. Automated high-throughput neurophenotyping of zebrafish social behavior. Journal of Neuroscience Methods. 210, (2), 266-271 (2012).
  30. Tytell, E. D. The hydrodynamics of eel swimming II. Effect of swimming speed. Journal of Experimental Biology. 207, (19), 3265-3279 (2004).
  31. Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). The Zebrafish Book. 4, (2000).
  32. Ying, L., Jiang, L., Bo, P., Yong, L. Teratogenic effects of embryonic exposure to pretilachlor on the larvae of zebrafish. Journal of Agro-Environment Science. 36, (3), 481-486 (2017).
  33. Macphail, R. C., et al. Locomotion in larval zebrafish: Influence of time of day, lighting and ethanol. Neurotoxicology. 30, (1), 52-58 (2009).
  34. Kais, B., et al. DMSO modifies the permeability of the zebrafish (Danio rerio) chorion-implications for the fish embryo test (FET). Aquatic Toxicology. 140, 229-238 (2013).
  35. Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. Drug Safety Evaluation. Springer. 271-279 (2011).
  36. Peeters, B. W., Moeskops, M., Veenvliet, A. R. Color preference in Danio rerio: effects of age and anxiolytic treatments. Zebrafish. 13, (4), 330-334 (2016).
  37. Barba-Escobedo, P. A., Gould, G. G. Visual social preferences of lone zebrafish in a novel environment: strain and anxiolytic effects. Genes, Brain and Behavior. 11, (3), 366-373 (2012).
  38. Blaser, R., Penalosa, Y. Stimuli affecting zebrafish (Danio rerio) behavior in the light/dark preference test. Physiology & Behavior. 104, (5), 831-837 (2011).
  39. Blaser, R. E., Rosemberg, D. B. Measures of anxiety in zebrafish (Danio rerio): dissociation of black/white preference and novel tank test. PloS One. 7, (5), e36931 (2012).
  40. Weichert, F. G., Floeter, C., Artmann, A. S. M., Kammann, U. Assessing the ecotoxicity of potentially neurotoxic substances-Evaluation of a behavioural parameter in the embryogenesis of Danio rerio. Chemosphere. 186, 43-50 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics