Untersuchung neurobehavioraler Auswirkungen von Umweltschadstoffen auf Zebrafischlarven

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Summary

Ein detailliertes experimentelles Protokoll wird in diesem Beitrag zur Bewertung der neurobehavioralen Toxizität von Umweltschadstoffen unter Verwendung eines Zebrafischlarvenmodells vorgestellt, einschließlich des Expositionsprozesses und Tests für neurobehaviorale Indikatoren.

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Zhang, B., Yang, X., Zhao, J., Xu, T., Yin, D. Studying Neurobehavioral Effects of Environmental Pollutants on Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (156), e60818, doi:10.3791/60818 (2020).

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Abstract

In den letzten Jahren haben sich immer mehr Umweltschadstoffe als neurotoxisch erwiesen, vor allem in den frühen Entwicklungsstadien von Organismen. Zebrafischlarven sind ein herausragendes Modell für die neurobehaviorale Untersuchung von Umweltschadstoffen. Hier wird ein detailliertes Versuchsprotokoll für die Bewertung der Neurotoxizität von Umweltschadstoffen mit Zebrafischlarven, einschließlich der Entnahme der Embryonen, des Expositionsprozesses, neurobehavioraler Indikatoren, des Testprozesses und Datenanalyse. Außerdem werden die Kulturumgebung, der Expositionsprozess und die experimentellen Bedingungen diskutiert, um den Erfolg des Assays sicherzustellen. Das Protokoll wurde bei der Entwicklung psychopathischer Medikamente, der Erforschung neurotoxischer Umweltschadstoffe, verwendet und kann optimiert werden, um entsprechende Studien zu erstellen oder für mechanistische Studien hilfreich zu sein. Das Protokoll zeigt einen klaren Operationsprozess zur Untersuchung neurobehavioraler Wirkungen auf Zebrafischlarven und kann die Auswirkungen verschiedener neurotoxischer Substanzen oder Schadstoffe aufzeigen.

Introduction

In den letzten Jahren wurden immer mehr Umweltschadstoffe neurotoxisch1,2,3,4. Die Bewertung der Neurotoxizität in vivo nach Exposition gegenüber Umweltschadstoffen ist jedoch nicht so einfach wie die der endokrinen Störung oder der Entwicklungstoxizität. Darüber hinaus hat die frühzeitige Exposition gegenüber Schadstoffen, insbesondere in umweltrelevanten Dosen, in Toxizitätsstudien5,6,7,8zunehmend Aufmerksamkeit erregt.

Zebrafisch wird als Tiermodell etabliert, das für Neurotoxizitätsstudien während der frühen Entwicklung nach der Exposition gegenüber Umweltschadstoffen geeignet ist. Zebrafische sind Wirbeltiere, die sich nach der Befruchtung schneller entwickeln als andere Arten. Die Larven müssen nicht gefüttert werden, da die Nährstoffe im Chorion ausreichen, um sie für 7 Tage nach der Befruchtung zu erhalten (dpf)9. Larven kommen aus dem Chorion bei 2 dpf und entwickeln Verhaltensweisen wie Schwimmen und Drehen, die beobachtet, verfolgt, quantifiziert und automatisch mit Verhaltensinstrumenten10,11,12,13 ab 3-4 dpf14,15,16,17,18analysiert werden können. Darüber hinaus können Hochdurchsatztests auch durch Verhaltensinstrumente realisiert werden. So sind Zebrafischlarven ein herausragendes Modell für die neurobehaviorale Untersuchung von Umweltschadstoffen19. Hier wird ein Protokoll mit Hochdurchsatzüberwachung angeboten, um die neurobehaviorale Toxizität von Umweltschadstoffen auf Zebrafischlarven unter Lichtreizen zu untersuchen.

Unser Labor hat die neurobehaviorale Toxizität von 2,2',4,4'-Tetrabromodiphenylether (BDE-47)20,21, 6'-Hydroxy/Methoxy-2,2',4,4'-Tetrabromodiphenylether (6-OH/MeO-BDE-47)22, deca-bromiertes Diphenylether (BDE-209), Blei, und kommerziellen chlorierten Paraffinen23 unter Verwendung des vorgelegten Protokolls. Viele Labore verwenden auch das Protokoll, um die neurobehavioralen Auswirkungen anderer Schadstoffe auf Larven oder erwachsene Fische24,25,26,27zu untersuchen. Dieses neurobehaviorale Protokoll wurde verwendet, um mechanistische Unterstützung zu bieten, die zeigt, dass eine niedrig dosierte Exposition gegenüber Bisphenol A und Ersatzbisphenol S eine vorzeitige hypothalamische Neurogenese bei embryonalen Zebrafischeninduzierte 27. Darüber hinaus optimierten einige Forscher das Protokoll, um entsprechende Studien durchzuführen. Eine kürzlich durchgeführte Studie eliminierte die Toxizität von Amyloid-Beta (A) in einem einfachen Zebrafischmodell mit hohem Durchsatz mit Kasein-beschichteten Gold-Nanopartikeln ( Es zeigte sich, dass sich die "Cas AuNPs" in systemischer Zirkulation über die Blut-Hirn-Schranke von Zebrafischlarven translozierten und intracerebral A-42 beschlagnahmten, was Toxizität in einer unspezifischen, chaperonähnlichen Weise hervorrief, die durch die Verhaltenspathologie unterstützt wurde28.

Fortbewegung, Pfadwinkel und soziale Aktivität sind drei neurobehaviorale Indikatoren, die verwendet werden, um die neurotoxischen Auswirkungen von Zebrafischlarven nach der Exposition gegenüber Schadstoffen im vorgestellten Protokoll zu untersuchen. Die Fortbewegung wird anhand des Schwimmabstandes von Larven gemessen und kann nach der Exposition gegenüber Schadstoffen beschädigt werden. Pfadwinkel und soziale Aktivität sind enger mit der Funktion des Gehirns und des zentralen Nervensystems verbunden29. Der Pfadwinkel bezieht sich auf den Winkel des Pfades der Tierbewegung relativ zur Schwimmrichtung30. Im System werden acht Winkelklassen von -180°-+180° eingestellt. Um den Vergleich zu vereinfachen, werden sechs Klassen im Endergebnis definiert als Routinedrehungen (-10° - 0°, 0° + 10°), durchschnittliche Umdrehungen (-10° - 90°, +10° +90°) und reaktionsschnelle Drehungen (-180° - 90°, +90° + +180°) nach unseren vorherigen Studien21,22. Zwei-Fisch-Soziale Aktivität ist grundlegend für Gruppen-Shoaling-Verhalten; hier wird ein Abstand von < 0,5 cm zwischen zwei gültigen Larven als sozialer Kontakt definiert.

Das hier vorgestellte Protokoll zeigt einen klaren Prozess zur Untersuchung neurobehavioraler Wirkungen auf Zebrafischlarven und bietet eine Möglichkeit, die neurotoxischen Wirkungen verschiedener Substanzen oder Schadstoffe aufzudecken. Das Protokoll wird Forschern zugute kommen, die an der Untersuchung der Neurotoxizität von Umweltschadstoffen interessiert sind.

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Protocol

Das Protokoll entspricht den Richtlinien, die von der Tierethikkommission der Universität Tongji genehmigt wurden.

1. Zebrafisch-Embryo-Sammlung

  1. Legen Sie zwei Paare gesunder erwachsener Tubingen-Zebrafische in der Nacht vor der Exposition in die Laichbox und halten Sie das Geschlechterverhältnis bei 1:1.
  2. Entfernen Sie die erwachsenen Fische zurück in das System 30-60 min nach Tageslicht am nächsten Morgen.
  3. Entfernen Sie die Embryonen aus dem Laichkasten.
  4. Spülen Sie die Embryonen mit Systemwasser.
  5. Übertragen Sie die Embryonen in eine glasige Petrischale (9 cm Durchmesser) mit genügend Systemwasser.
  6. Beobachten Sie die Embryonen unter dem Mikroskop und wählen Sie gesunde Embryonen für eine spätere Exposition aus.
    HINWEIS: Gesunde Embryonen sind in der Regel transparent mit heller goldener Farbe unter dem Mikroskop. Die ungesunden Embryonen sind in der Regel blass und verklumpt, wie unter dem Mikroskop beobachtet.

2. Vorbereitung vor Derexposition

  1. Bereiten Sie die Hanks-Lösung nach den Richtlinien des Zebrafischbuches31vor.
    HINWEIS: Die Hanks-Lösung umfasst 0,137 M NaCl, 5,4 mM KCl, 0,25 mM Na2HPO4, 0,44 mM KH2PO4, 1,3 mM CaCl2, 1,0 mM MgSO4und 4,2 mM NaHCO3.
  2. Verdünnen Sie die Hanks-Lösung mit sterilem Wasser zu 10% Hanks' Lösung.
  3. Fügen Sie 1 ml DMSO in 999 ml von 10% Hanks' Lösung hinzu, um eine Steuerungslösung von 10% Hanks' Lösung einschließlich 0,1% DMSO zu machen.
    HINWEIS: In den nächsten Schritten wird BDE-47 als Beispiel für eine Belichtungslösung verwendet.
  4. 5 mg des ordentlichen BDE-47 in 1 ml 100% DMSO auflösen, um eine Standard-Expositionslösung von 5 mg/ml herzustellen.
  5. Wirbel die 5 mg/ml Lösung für 1 min, um den BDE-47 im DMSO vollständig aufzulösen.
  6. Übertragen Sie 10 l der 5 mg/ml-Lösung in eine 12 ml braune Glasflasche.
  7. Fügen Sie sterilisiertes Wasser zu einem Endvolumen von 10 ml hinzu, um die Konzentration der BDE-47-Expositionslösung 5 mg/L und DMSO-Verhältnis bei 0,1% und dann Wirbel für 1 min zu machen.
  8. Übertragen Sie 10 l bzw. 100 l der 5 mg/L-Lösung in zwei 100 ml Volumetkolben.
  9. Fügen Sie die Lösung von 10% Hanks einschließlich 0,1% DMSO (in Schritt 2.3) bis 100 ml hinzu, um die Endkonzentrationen der BDE-47-Expositionslösungen 5 g/l bzw. 50 g/l herzustellen.
  10. Übertragen Sie die Lösungen in 100 ml braune Glasflaschen und lagern Sie sie bei 4 °C.

3. Exposition von Embryonen

  1. Übertragen Sie 50 Embryonen in jede der drei Glas-Petrischalen (6 cm Durchmesser) 3-5 Stunden nach der Befruchtung (hpf).
  2. Verwenden Sie eine 1 ml Pipettenspitze, um das Systemwasser um die Embryonen herum zu beulen.
  3. Verwenden Sie eine Pipette, um die Steuerung und zwei BDE-47 Belichtungslösungen (Steuerung, 5 g/L, 50 g/L) in die drei Glas-Petri-Schalen zu übertragen.
  4. Schütteln Sie die gläsernen Petrischalen sanft nacheinander, um die Embryonen im Boden der Platte zu zerstreuen.
  5. Die glasigen Petrischalen unter 28,5 °C in den Lichtbrutschrank geben.
  6. Erneuern Sie die Hälfte der Belichtungslösungen alle 24 h bis 5 dpf.
  7. Überprüfen Sie die toten Embryonen jeder Gruppe auf 1 dpf und 2 dpf und berechnen Sie die Sterberate.
  8. Überprüfen Sie die inkubierten Embryonen jeder Gruppe auf 2 dpf und 3 dpf und berechnen Sie die Schraffabilität.
  9. Überprüfen Sie die Deformität der Larven jeden Tag, nachdem sie aus dem Chorion herauskommen und berechnen Sie die Deformitätsrate jeder Gruppe.
    HINWEIS: Zu den Deformitätsindikatoren gehören Perikardzyste, Wirbelsäulenkrümmung, Schwanzkrümmung, unter anderem Faktoren32.

4. Vorbereitung auf den Verhaltenstest

  1. Bereiten Sie eine 48-Well-Mikroplatte für den Bewegungs- und Pfadwinkeltest und drei 6 Well-Mikroplatten für den social activity test am Morgen von 5 dpf vor.
  2. Übertragen Sie 800 l Belichtungslösung in jeden Brunnen der 48 Well-Mikroplatte.
    HINWEIS: Verwenden Sie 16 Bohrungen für jede Gruppe (d. h. die Steuerungslösung, 5 g/l und 50 g/l-Gruppe).
  3. Verwenden Sie eine 1 ml Pipettenspitze, um 200 l Belichtungslösung mit einer Larve aus der glasigen Petrischale in einen Brunnen der 48 Well-Mikroplatte zu übertragen.
  4. Übertragen Sie 4 ml Belichtungslösung in jeden Brunnen der 6 Well-Mikroplatte.
    HINWEIS: Verwenden Sie eine 6 Well-Mikroplatte für jede Gruppe.
  5. Verwenden Sie eine 1 ml Pipettenspitze, um 200 l Belichtungslösung mit zwei Larven in jeden Brunnen der 6 Well-Mikroplatte zu übertragen.
    HINWEIS: Jede Gruppe hat sechs sich wiederholende Gruppen.
  6. Stellen Sie vor dem Test sicher, dass die Temperatur des Prüfraums 28 °C 2 h beträgt.
    HINWEIS: Verhaltenstests werden in der Regel am Nachmittag durchgeführt.

5. Verhaltenstest

  1. Bewegungs- und Pfadwinkelprüfung
    1. Klicken Sie auf das Launcher-Symbol auf dem Computer-Schreibtisch, um die Software zu öffnen (siehe Tabelle der Materialien), die das Überwachungsgehäuse mit hohem Durchsatz steuert, um das Programm zu starten.
    2. Wählen Sie das Modul "Tracking, Rotations, Path Angles", um die Bedienoberfläche einzugeben.
    3. Übertragen Sie die in Schritt 4.3 vorbereitete 48-Well-Mikroplatte auf die Aufnahmeplattform und ziehen Sie die Abdeckung nach unten.
    4. Klicken Sie in der Software auf die Schaltfläche "Datei" ""Protokollgenerieren ", um mit der Generierung eines neuen Protokolls zu beginnen.
    5. Geben Sie "48" in die Position "Location count" ein und klicken Sie auf die Schaltfläche "OK".
    6. Klicken Sie in der Software auf die Schaltfläche "Parameter" "Protokollparameter" " "Zeit". Stellen Sie die Versuchsdauer auf 1 h und 10 min und die Integrationsdauer auf 60 s33ein.
    7. Zeichnen Sie die erkannten Bereiche.
      1. Wählen Sie die elliptische Form aus und zeichnen Sie den ersten Kreis um den ersten oberen linken Brunnen.
      2. Wählen Sie den Kreis aus, klicken Sie auf die Schaltfläche "Kopieren"" "Oben-Rechts-Markierung"" " "Auswählen"und ziehen Sie den kopierten Kreis mit der Maus nach oben rechts.
      3. Wählen Sie den Kreis aus, klicken Sie auf die Schaltfläche "Kopieren" "Bottom Mark"" " "Select" und verwenden Sie die Maus, um den kopierten Kreis gut nach unten rechts zu ziehen.
      4. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Build" "Clear marks".
        HINWEIS: Das System zieht automatisch jeden anderen Brunnen der Platte. Die neu geschaffenen Flächen sollten perfekt zwischen den eigentlichen Fischen und ihrer Reflexion auf der Seite des Brunnens passen.
    8. Klicken Sie auf die Schaltfläche"Skalen zeichnen", zeichnen Sie eine Kalibrierungslinie auf dem Bildschirm (ein diagonaler Pfad oder parallel zur Seite der Mikroplatte), geben Sie ihre Länge ein und legen Sie die "Einheit" fest. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche "Gruppen anwenden".
    9. Legen Sie die Tierfarbe in der Software auf "Schwarz" fest.
    10. Legen Sie den Nachweisschwellenwert auf 16-18 fest, um die Erkennung der Tiere zu ermöglichen.
    11. Eingabe inaktiv/klein und klein/groß bei 0,5 cm/s bzw. 2,5 cm/s.
    12. Legen Sie die Pfadwinkelklassen fest. Eingabe "-90, -30, -10, 0, 10, 30 und 90", um Pfadwinkelklassen von -180°-+180° zu erstellen.
    13. Einstellen der Lichtverhältnisse
      1. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Parameter"" Light driving" verwendet eine der 3auslösenden Methoden unter"Enhanced stimuli" , um die Lichtverhältnisse einzustellen.
      2. Wählen Sie die Schaltfläche "Kante" und legen Sie dann eine dunkle Periode von 10 min fest, gefolgt von drei Zyklen mit abwechselnden 10 min hellen und dunklen Perioden.
    14. Speichern Sie das Protokoll, und schalten Sie das Licht des Testraums aus.
    15. Akklimatisieren Sie die Larven im System für 10 min und klicken Sie auf die Schaltfläche "Experiment" "Ausführen",wählen Sie dann den Ordner aus, in dem die Experimentierdateien gespeichert werden, und geben Sie den Ergebnisnamen ein.
    16. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Hintergrund" "Starten", um den Test zu starten.
    17. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Experiment" "Stop", um das Experiment zu beenden, wenn der Test endet.
      HINWEIS: Das System zeigt die Daten an, die beim Anhalten des Systems getestet wurden. Die Daten umfassen den verfolgten Abstand bei drei Geschwindigkeitsklassen und Pfadwinkelnummern bei acht Winkelklassen pro Minute. Für den Fortbewegungstest im vorgestellten Beispiel wird die Gesamtentfernung in jeder Lichtperiode (10 min) berechnet und die Differenz zwischen der Kontrollgruppe und den Behandlungsgruppen verglichen.
    18. Übertragen Sie die 48 Well-Mikroplatte für andere Experimente zurück auf den Licht-Inkubator.
  2. Sozialer Aktivitätstest
    1. Klicken Sie auf das Launcher-Symbol auf dem Computer-Schreibtisch, um die Software zu öffnen, die das Überwachungsgehäuse mit hohem Durchsatz steuert, um das Programm zu starten.
    2. Wählen Sie das Modul "Soziale Interaktionen", um die Bedienoberfläche einzugeben.
    3. Übertragen Sie die vorbereitete 6 Well-Mikroplatte (Steuergruppe) in Schritt 4.4 auf die Aufnahmeplattform und ziehen Sie die Abdeckung nach unten.
    4. Klicken Sie in der Software auf die Schaltfläche "Datei" ""Protokollgenerieren ", um mit der Generierung eines neuen Protokolls zu beginnen.
    5. Geben Sie "6" in die Position "Location count" ein und klicken Sie auf die Schaltfläche "OK".
    6. Klicken Sie in der Software auf die Schaltfläche "Parameter" "Protokollparameter" " "Zeit". Stellen Sie die Experimentdauer auf 1 h und 10 min und die Integrationsdauer auf 60 s.
    7. Zeichnen Sie die erkannten Bereiche.
      1. Wählen Sie die elliptische Form aus und zeichnen Sie den ersten Kreis um den ersten oberen linken Brunnen.
      2. Wählen Sie den Kreis aus, klicken Sie auf die Schaltfläche "Kopieren"" "Oben-Rechts-Markierung"" " "Auswählen"und ziehen Sie den kopierten Kreis mit der Maus nach oben rechts.
      3. Wählen Sie den Kreis aus, klicken Sie auf die Schaltfläche "Kopieren" "Bottom Mark"" " "Select" und verwenden Sie die Maus, um den kopierten Kreis gut nach unten rechts zu ziehen.
      4. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Build" "Clear marks".
        HINWEIS: Die neu geschaffenen Bereiche sollten perfekt zu jedem gut passen und zwischen den eigentlichen Larven und ihrer Reflexion auf der Seite des Brunnens.
    8. Klicken Sie auf die Schaltfläche"Skalen zeichnen", zeichnen Sie eine Kalibrierungslinie im Bildschirm (ein diagonaler Pfad oder parallel zur Seite der Mikroplatte), geben Sie ihre Länge ein und legen Sie die "Einheit" fest. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche "Gruppen anwenden".
    9. Legen Sie den Nachweisschwellenwert auf 16-18 fest, um die Erkennung der Tiere zu ermöglichen.
    10. Klicken Sie in der Software auf die Schaltfläche "Schwarzes Tier".
    11. Wählen Sie die Schaltfläche "Abstandsschwelle" und geben Sie "5" in die Software ein.
    12. Stellen Sie die Lichtverhältnisse ein.
      1. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Parameter"" Light driving" verwendet eine der 3auslösenden Methoden unter"Enhanced stimuli" , um die Lichtverhältnisse einzustellen.
      2. Wählen Sie die Schaltfläche "Kante" und legen Sie dann eine dunkle Periode von 10 min fest, gefolgt von drei Zyklen mit abwechselnden 10 min hellen und dunklen Perioden.
    13. Speichern Sie das Protokoll und schalten Sie das Licht des Raumes aus.
    14. Akklimatisieren Sie die Larven im System für 10 min und klicken Sie auf die Schaltfläche "Experiment" "Ausführen",wählen Sie dann den Ordner aus, in dem die Experimentierdateien gespeichert werden, und geben Sie den Ergebnisnamen ein.
    15. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Hintergrund" "Starten", um den Test zu starten.
    16. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Experiment" "Stop" , um das Experiment in der Software zu beenden, wenn der Test endet.
      HINWEIS: Das System zeigt die Daten an, die beim Anhalten des Systems getestet wurden.
    17. Übertragen Sie die 6 Well-Mikroplatte (Kontrollgruppe) für andere Experimente zurück auf den Lichtinkubator.
    18. Übertragen Sie die 6 Well-Mikroplatten (5 g/L- und 50-g/L-Gruppen) wiederum auf die Aufnahmeplattform und wiederholen Sie die Schritte von 5.2.4 bis 5.2.17 durch Ordinal.

6. Datenanalyse

  1. Öffnen Sie die Tabellenkalkulationsdatei in den Ergebnissen für Fortbewegung und Pfadwinkel.
  2. Wählen Sie die drei Abstandsspalten (inadist, smldist, lardist) und addieren Sie sie.
    HINWEIS: Die Daten von Inadist, smldistund lardist bedeuten unterschiedliche Entfernungen, die vom System in verschiedenen Geschwindigkeitsklassen (inaktiv/klein/groß) aufgezeichnet werden.
  3. Berechnen Sie für jede 10-minütige Lichtperiode die Entfernung jedes Brunnens, berechnen Sie die durchschnittliche Entfernung von 16 Brunnen und vergleichen Sie die Daten der drei Gruppen unter Lichtreizen.
  4. Fassen Sie für jede 10-minütige Lichtperiode die Winkelzahl jedes Brunnens in jeder Lichtdauer von cl01 bis cl08 nacheinander zusammen, und vergleichen Sie die Daten der drei Gruppen unter Lichtreizen.
    HINWEIS: Die Daten von Spalten von cl01 bis cl08 bedeuten unterschiedliche Pfadwinkelnummern, die vom System in unterschiedlichen Pfadwinkeln aufgezeichnet werden.
  5. Öffnen Sie die Tabellenkalkulationsdatei in den Ergebnissen der sozialen Aktivität.
  6. Wählen Sie die Contct- und Contdur-Säulen aus, und summieren Sie für jede 10 minuten Lichtperiode die gesellschaftlichen Zeiten und ihre Dauer für jeden Brunnen.
  7. Berechnen Sie die durchschnittlichen sozialen Zeiten und die Dauer einer Gruppe in jeder Lichtdauer und vergleichen Sie die Daten der drei Gruppen unter Lichtreizen.

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Representative Results

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Untersuchung der neurobehavioralen Auswirkungen von Umweltschadstoffen mit Zebrafischlarven unter Lichtreizen. Die Fortbewegungs-, Pfadwinkel- und sozialen Aktivitätstests werden in der Einleitung definiert. Die Einrichtung der Mikroplatten in den Bewegungs- und Pfadwinkeltests sowie die Bilder der Software sind unten dargestellt. Darüber hinaus werden unsere eigenen Forschungsergebnisse als Beispiele vorgestellt. Zwei Studien zeigen die Bewegungs- und Pfadwinkeleffekte nach Exposition gegenüber BDE-47 und 6-OH/MeO-BDE-47. Die dritte Studie stellt die Auswirkungen von vier kommerziellen chlorierten Parafopen auf das Sozialverhalten vor.

Der Aufbau der 48 Well-Mikroplatte und der Bewegungsort der Larven im Bewegungs- und Pfadwinkeltest.
Im Protokoll wurden drei Gruppen verwendet, darunter eine Kontrollgruppe und zwei Behandlungsgruppen. Da jede Gruppe 16 Tiere haben kann, kann das System verwendet werden, um Hochdurchsatztests von Fortbewegung und Pfadwinkel in einer Mikroplatte durchzuführen. Abbildung 1 zeigt eine Larve, die mit der Steuerungslösung, der 5-g/L-Lösung und der 50-g/L-Lösung in jeder Bohrung der ersten, mittleren und letzten beiden Reihen behandelt wird.

Abbildung 1 zeigt auch alle Bewegungs-Loci der Larven in den Fortbewegungs- und Pfadwinkeltests. Das System verfolgte die Fortbewegung der Larven und berechnete die Schwimmdistanz in verschiedenen Geschwindigkeitsklassen. Das System berechnete die Pfadwinkelzahlen von Larven in verschiedenen Pfadwinkelklassen. Die Forscher können die vom System aufgezeichneten Daten auf ihre eigene Weise analysieren.

Figure 1
Abbildung 1: Die Einrichtung der 48 Well-Mikroplatte und die Bewegungs-Loci der Larven im Bewegungs- und Pfadwinkeltest. A1-A8, B1-B8 = die Kontrollgruppe; C1-C8, D1-D8 = die Gruppe 5 g/L; E1-E8, F1-F8 = die Gruppe 50 g/L. Die schwarze Farbverfolgungslinie bedeutet Inaktivität oder kleine Bewegungen; die grüne Farbverfolgungslinie bedeutet normale Bewegungen; und die rote Farbverfolgungslinie bedeutet große Bewegungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die 6 Well Mikroplatte im Social Activity Test.
Abbildung 2 zeigt eine 6-Well-Mikroplatte im Prozess der Prüfung sozialer Aktivitäten. Jeder Brunnen hatte zwei Larven, und das System zeichnete den Abstand zwischen den beiden Larven während des gesamten Testprozesses auf. Das System zeichnete die Anzahl der sozialen Aktivitäten und die Dauer in der eingestellten Testzeit (1 min in diesem Protokoll) auf.

Figure 2
Abbildung 2: Die 6 Well-Mikroplatte im Test der sozialen Aktivität. Jeder Brunnen hatte zwei Larven. Die gelbe Linie bedeutet, dass der Abstand zwischen zwei Tieren < 0,5 cm beträgt; Die rote Linie bedeutet, dass der Abstand zwischen zwei Tieren > 0,5 cm beträgt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

BDE-47 Exposition beeinflusste die Fortbewegung bei Zebrafischlarven bei 5 dpf.
Wie in Abbildung 3dargestellt, erzeugte die höchste Konzentrationsgruppe von BDE-47 während der dunklen Periode eine ausgeprägte Hypoaktivität. Es gab jedoch keine beobachteten Veränderungen aufgrund der BDE-47-Exposition während der Lichtperioden.

Figure 3
Abbildung 3: Auswirkungen der BDE-47-Exposition auf die Fortbewegung von Larvenzebrafischen bei 5 dpf. Die Fortbewegung (in cm gemessene Entfernung) wurde in abwechselnden Perioden der Dunkelheit und des Lichts für eine Gesamtdauer von 70 min aufgezeichnet. Feste und offene Balken am Boden zeigen dunkle bzw. helle Perioden an. Die Daten werden als Mittelwert -SEM (*p < 0,05 im Vergleich zur Kontrollgruppe) dargestellt. Diese Zahl wurde von Zhao et al.17 mit Genehmigung geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

6-OH/MeO-BDE-47 Exposition beeinflusste die Pfadwinkel von Zebrafischlarven bei 5 dpf.
Wie in Abbildung 4dargestellt, führte die hochkonzentrierte Gruppe von 6-OH-BDE-47 weniger Routineumdrehungen und durchschnittliche Drehungen bei 5 dpf durch. Jedoch wurden reaktionsschnellere Wendungen durch 6-MeO-BDE-47 Expositionsgruppen induziert.

Figure 4
Abbildung 4: Auswirkungen von 6-OH/MeO-BDE-47 auf den Pfadwinkel von Larvenzebrafischen während der dunklen Periode. Die Daten werden als Mittelwert -SEM (*p < 0,05 im Vergleich zur Steuerung) dargestellt. Diese Zahl wurde von Zhang et al.18 mit Genehmigung geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Exposition von CPs wirkte sich auf die soziale Aktivität von Zebrafischlarven bei 5 dpf aus.
Wie in Abbildung 5dargestellt, wurde das sozialgegaltische Verhalten von Zebrafischlarven durch drei CP-Produkte beeinflusst. Die soziale Aktivität wurde durch CP-70 und die Kurzketten-CP-52b angeregt. Die lange Kette CP-52a verkürzte die Dauer pro Kontakt der Larven.

Figure 5
Abbildung 5: Auswirkungen von CPs auf die durchschnittliche soziale Dauer pro Kontakt in verschiedenen Hell-Dunkel-Perioden. (A) CP-42, (B) CP-52a, (C) CP-52b, (D) CP-70. Die Daten werden als Mittelwert -SEM (*p < 0,05 im Vergleich zum Steuerelement) dargestellt. Diese Zahl wurde von Yang et al.19 mit Genehmigung geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Diese Arbeit liefert ein detailliertes experimentelles Protokoll zur Bewertung der Neurotoxizität von Umweltschadstoffen unter Verwendung von Zebrafischlarven. Zebrafische durchlaufen den Prozess von Embryonen bis zu Larven während der Expositionsphase, was bedeutet, dass eine gute Versorgung der Embryonen und Larven unerlässlich ist. Alles, was die Entwicklung der Embryonen und Larven beeinflusst, kann das Endergebnis beeinflussen. Hier werden die Kulturumgebung, der Belichtungsprozess und die experimentellen Bedingungen diskutiert, um den Erfolg des gesamten Assays zu gewährleisten.

Für die Kulturumgebung leben Zebrafischembryonen und Larven unter einer stabilen Temperatur von 28 °C. In dieser Arbeit wird ein Licht-Inkubator verwendet, der die Lichtverhältnisse automatisch einstellen und die Temperatur stabil halten kann, um die Embryonen und Larven zu beherbergen. Die Embryonen kommen nicht aus dem Chorion bei 1 dpf und 2 dpf, daher sollte darauf geachtet werden, dass die ungeschlüpften Embryonen bei der Erneuerung der Expositionslösung nicht beschädigt werden. Außerdem sollte das Verhältnis von DMSO in der Lösung unter 0,1%34,35, und die frische Expositionslösung sollte bei 28 °C sein, bevor sie für die Erneuerung verwendet wird.

Der Prozess der Auswahl von Embryonen vor der Exposition ist auch ein Schlüsselfaktor für den Erfolg des Experiments. Die Wahl gesunder Embryonen, die gleichzeitig für jede Gruppe entwickelt werden, garantiert die Genauigkeit der Toxizitätsbewertung. Zebrafische können in den ersten 7 Tagen nach der Befruchtung ohne Nahrung leben, daher ist es am besten, die Embryonen oder Larven während der gesamten Expositionsperiode nicht zu füttern, da Nahrung das Endergebnis beeinflussen könnte. Außerdem ist es am besten, die Belichtungslösung bei Bedarf frisch vorzubereiten.

Während des Verhaltenstests ist es wichtig, den Larven genügend Zeit zu bieten, um sich an die Umgebung des Überwachungsgehäuses mit hohem Durchsatz anzupassen. Vor dem Test sollte jeder Schritt des getesteten Protokolls sorgfältig überprüft werden, einschließlich lichtbedingter Bedingungen, Testzeit usw. Der Testraum sollte komplett ruhig und dunkel gehalten werden, um die Tiere nicht zu stören.

Das vorgelegte Protokoll bietet einen grundlegenden Rahmen, um die neurobehaviorale Toxizität von Umweltschadstoffen zu untersuchen. Es gibt auch andere Arten von Verhaltensweisen, die bei der Untersuchung neurobehavioraler Effekte verwendet werden, wie Farbpräferenztests36, Bodenbehausungstests37, Hell-/Dunkelpräferenztests38,39, etc. Bei diesen Tests werden jedoch hauptsächlich erwachsene Zebrafische verwendet, die nicht für Tests mit hohem Durchsatz geeignet sind. Darüber hinaus zeigten Weichert et al. das Verhalten spontaner Schwanzbewegungen, die kurz nach 24 h Belichtung quantifiziert werden konnten40. Die Bewertung der neurobehavioralen Toxizität umfasst auch Mechanismusstudien über die Funktion des Gehirns und des zentralen Nervensystems. Die grundlegenden neurobehavioralen Indikatoren werden hier eingeführt und können die Grundlage für komplexere Indikatoren mit anderen Verhaltensinstrumenten bilden. Letztlich kann die Entwicklung neuer neurobehavioraler Indikatoren, die mit diesem Studienmechanismus einhergehen, in zukünftigen Studien verwendet werden.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Die Autoren sind dankbar für die finanzielle Unterstützung durch die National Natural Science Foundation of China (21876135 und 21876136), das National Major Science and Technology Project of China (2017ZX07502003-03, 2018ZX07701001-22), die Stiftung von MOE-Shanghai Key Laboratory of Children es Environmental Health (CEH201807-5) und Swedish Research Council (Nr. 639-2013-6913).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
48-well-microplate Corning 3548 Embyros housing
6-well-microplate Corning 3471 Embyros housing
BDE-47 AccuStandard 5436-43-1 Pollutant
DMSO Sigma 67-68-5 Cosolvent
Microscope Olympus SZX 16 Observation instrument
Pipette Eppendorf 3120000267 Transfer solution
Zebrabox Viewpoint ZebraBox Behavior instrument
Zebrafish Shanghai FishBio Co., Ltd. Tubingen Zebrafish supplier
ZebraLab Viewpoint ZebraLab Behavior software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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