Een Multi-compartimenten CNS Neuron-glia Co-cultuur Microfluïdische Platform

Summary

We ontwikkelden een nieuw meerdere compartimenten neuron co-cultuur microsysteem platform voor in-vitro CNS axon-glia interactie onderzoek. Het platform is in staat het uitvoeren van maximaal zes onafhankelijke experimenten in parallel en werd vervaardigd met behulp van een nieuw ontwikkelde macro / micro hybrid fabricage methode.

Abstract

We presenteren een nieuw meerdere compartimenten neuron co-cultuur microsysteem platform voor in-vitro CNS axon-glia interactie tussen onderzoek, in staat is het uitvoeren van maximaal zes onafhankelijke experimenten in parallel voor een hogere throughput. Ontwikkelden we een nieuwe fabricage methode om microfluïdische apparaten met zowel micro-en macro-schaal structuren binnen het hetzelfde apparaat via een soft-lithografie-proces te creëren, waardoor de massa productie met een goede herhaalbaarheid.

De multi-compartimenten microfluïdische co-cultuur platform is samengesteld uit een soma compartiment voor neuronen en zes axon / glia vakken voor oligodendrocyten (OLS). De soma compartiment en axon / gliacellen compartimenten zijn met elkaar verbonden door arrays van axon-guiding microkanalen die functioneren als fysieke barrières voor neuronale soma beperken in de soma compartiment, terwijl axonen uit te groeien tot axon / glia compartimenten. OLS geladen in axon / glia compartimenten kunnen alleen communiceren met axonen, maar niet met neuronale soma of dendrieten, waardoor gelokaliseerde axon-glia interactiestudies. De microkanalen het ook mogelijk vloeibare isolatie tussen compartimenten, waardoor zes onafhankelijke experimenten worden uitgevoerd op een enkel apparaat voor een hogere doorvoersnelheid.

Soft-lithografie met behulp van poly (dimethylsiloxaan) (PDMS) is een veel gebruikte techniek in de biomedische Microdevices. Reservoirs op deze apparaten worden vaak bepaald door handmatig perforeren. Hoewel eenvoudige, slechte afstemming en tijdrovend karakter van het proces maakt dit proces niet geschikt wanneer grote aantallen reservoirs moeten herhaaldelijk worden gecreëerd. De nieuw ontwikkelde methode niet vereisen handmatige perforeren van de reservoirs, het overwinnen van dergelijke beperkingen. Eerste zeven reservoirs (diepte: 3,5 mm) werden gemaakt op een poly (methyl methacrylaat) (PMMA) blokkeren met behulp van een micro-freesmachine. Dan, arrays van nok microstructuren, gefabriceerd op een glazen substraat, waren hot-reliëf tegen de PMMA blok aan microkanalen dat de soma en axon / gliacellen compartimenten verbinden definiëren. Dit proces heeft geleid tot de macro-schaal reservoirs (3,5 mm) en micro-schaal kanalen (2,5 micrometer) te laten samenvallen in een enkele PMMA meester. Een PDMS replica die diende als een mal meester werd verkregen met behulp van soft-lithografie en het uiteindelijke PDMS apparaat werd gerepliceerd van deze meester.

Primaire neuronen van de E16-18 ratten werden geladen om de soma compartiment en gekweekt voor twee weken. Na een week van celkweek, axonen gekruist microkanalen en vormde axonale alleen netwerklaag binnen axon / glia compartimenten. Axonen groeide gelijkmatig in zes axon / glia compartimenten en OLS van P1-2 ratten werden toegevoegd aan axon / glia compartimenten op 14 dagen in vitro voor co-cultuur.

Protocol

Deel 1: Het voorbereiden van een meester mal voor meerdere compartimenten neuron co-cultuur apparaat fabricage

1. Eerste stap om de PMMA meester fabriceren is om 3,5 mm diep compartimenten. Een soma compartiment en zes axon / glia compartimenten zijn gedefinieerd op een PMMA blok met behulp van een micro-freesmachine (MDX-40, Roland of enige andere CNC freesmachine). PMMA meester is dan gesoniceerd in isopropylalcohol gedurende 10 minuten om vuil te verwijderen.
2. Arrays van 2,5 micrometer hoge bergrug structuren zijn patroon op een 50,8 mm x 50,8 mm glas dia door een standaard-fotolithografie proces, gevolgd door een nat etsen van het glas.
   Eerst worden array van ridge structuren patroon op een gereinigde glazen substraat met een positieve fotolak S1818 met behulp van fotolithografie. S1818 is spin-coating op het substraat (4000 rpm), zachte gebaseerd op 110 ° C gedurende 5 min, en vervolgens blootgesteld aan UV-licht (84 mJ / cm ²⁾ met behulp van een masker aligner, gevolgd door de ontwikkeling van de fotoresist in MF319 voor 40 seconden. Vervolgens wordt de fotoresist figuurglas substraat is ingebed in een gebufferde oxide etsen (BOE) bij kamertemperatuur voor 6-7 minuten tot een 2.5 micrometer grote bergkam structuren te verkrijgen. Ten slotte wordt de fotolak laag verwijderd door aceton en isopropylalcohol, gevolgd door grondig spoelen in gedeïoniseerd (DI) water.
3. Glazen substraat met micro-ridge structuren is hot-reliëf tegen de PMMA meester zijn patronen te dragen.
   Eerst worden PMMA schimmel meester en glazen substraten handmatig op elkaar afgestemd en geplaatst op een hot-pers. Vervolgens wordt de temperatuur verhoogd tot 115 ° C. Zodra de gewenste temperatuur is bereikt, 0,5 ton gewicht wordt toegepast gedurende 5 minuten. Na 5 minuten wordt de temperatuur afgekoeld tot 40 ° C en de druk wordt vrijgegeven. De PMMA master is dan gesneden in een 50,8 mm x 50,8 mm groot blok.
4. PDMS pre-polymeer (Sylgard 184) wordt gemengd met verharder in de verhouding van 10: 1 door het gewicht.
5. PMMA master is geplaatst in een vat en PDMS mengsel wordt uitgegoten op de top van de PMMA meester om een ​​PDMS meester fabriceren. Het wordt dan geplaatst in een exsiccator is aangesloten op een vacuümpomp. PDMS goot op de top van PMMA master is vervolgens ontgast gedurende 15 minuten om belletjes die tijdens het PDMS mengproces te verwijderen.
6. Als alle bubbels worden verwijderd, is het PDMS gezet in een waterpas 85 ° C oven gedurende een uur voor de polymerisatie.
7. Zodra PDMS is volledig uitgehard, is PDMS meester afgepeld van de PMMA master en geplaatst in een exsiccator met 2-3 druppels trichloorsilaan en gestofzuigd gedurende 15 minuten aan damp de vacht van de PDMS meester oppervlak. Trichloorsilaan coating vergemakkelijkt de release van de uiteindelijke PDMS neuron co-cultuur apparaten van de PDMS meester. Na het coaten, is het PDMS meester kort gespoeld met isopropyl alcohol aan overmatige trichloorsilaan te verwijderen, en gedroogd met N ₂ gas.

Deel 2: Neuron cultuur-apparaat replicatie

1. PDMS pre-polymeer (Sylgard 184) wordt gemengd met verharder in de verhouding van 10: 1 door het gewicht.
2. PDMS mengsel wordt uitgegoten op de top van de PDMS meester en ontgast in een exsiccator is aangesloten op een vacuümpomp voor 15 minuten. Het is belangrijk niet te gieten teveel PDMS dat de 3,5 mm hoog PDMS-structuur op de master niet volledig is ondergedompeld.
3. Als alle bubbels worden verwijderd, is het PDMS gezet in een waterpas 85 ° C oven gedurende een uur voor de polymerisatie.
4. PDMS wordt genomen uit de oven na een uur en bij kamertemperatuur afkoelen. Vervolgens worden PDMS neuron cultuur apparaten voorzichtig afgepeld van de PDMS meester. Afgepeld PDMS-apparaten zijn omwikkeld met parafilm om hen te beschermen tegen stof of vuil.
5. PDMS-apparaten, omwikkeld met parafilm, worden gesneden in individuele stukken met behulp van een boor pers uitgerust met een mes.

Deel 3: Apparaat assemblage

1. PDMS neuron cultuur apparaat is geplaatst in het plasma schoner en blootgesteld aan de lucht plasma gedurende 90 seconden om het oppervlak van het PDMS apparaat hydrofiel. Dit plasma behandeling zullen vergemakkelijken microkanalen te vullen met cultuur media na de montage aan poly-D-lysine gecoate substraat.
2. Apparaten die behandeld worden met plasma worden dan ondergedompeld in 70% ethanol gedurende 30 minuten voor sterilisatie en verhuisde in de gesteriliseerde bio-kap.
3. Gesteriliseerd apparaten zijn genomen uit 70% ethanol en gedroogd met Millipore gefilterd N ₂ gas. Gedroogde apparaten zijn geplaatst op de top van poly-D-lysine gecoate polystyreen 6-well plaat en cultuur zachte druk wordt toegepast op de afdichting tussen het substraat en het apparaat te verzekeren.
4. Kweekmedia wordt dan gevuld in de soma compartiment, gevolgd door het vullen van de zes axon / glia compartimenten. Het is beter te geven 1-2 minuten pauze voor het vullen van axon / glia vakken na het toevoegen van cultuur media om de soma compartiment om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen worden opgesloten in de microkanalen.
5. Apparaten gevuld met cultuur media wordt geïncubeerd in een 37 ° C incubator 's nachts om eventuele vuil of giftige residu te spoelen.

Deel 4: Cel laden en neuron-oligodendrocyt co-cultuur

1. Op de eerste dag van de celkweek, primaire voorhersenen neuron cellen van embryonale dag 16-18 ratten zijn geladen in het soma compartiment op een oppervlaktedichtheid van 500 cellen / mm ^2. Ten eerste, zijn cultuur media in zowel de soma compartiment en axon / gliacellen compartimenten opgezogen met behulp van een pipet voorafgaand aan de cel laden. Dan worden 38.500 cellen, verdund in 40 ul van cultuur media, geladen op de soma compartiment rond de microkanaal inhammen. Het is belangrijk dat u de PDMS-toestel aanraken tijdens het laden van de cellen, omdat het kan breken de afdichting tussen het apparaat en de ondergrond.
2. Incubeer de cel geladen apparaten voor 30 minuten in een 37 ° C incubator naar cel adhesie te verbeteren aan de ondergrond. Na incubatie worden alle compartimenten gevuld met cultuur media.
3. Cellen worden gekweekt bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO ₂ incubator en slechts de helft van de cultuur media is veranderd op om de 3-4 dagen.
4. Na 14 dagen van neuron cultuur in vitro, zijn oligodendrocytes toegevoegd aan het axon / glia compartimenten voor co-cultuur. Oligodendrocyten, ontleed van de hersenhelften van Sprague-Dawley ratten bij postnatale dag 1-2, worden toegevoegd aan elk axon / glia compartiment op een oppervlakte dichtheid van 1000 cellen / mm ^2. Voorafgaand aan het laden van cellen, zijn ongeveer 60% van de cultuur media in de vakken afgezogen met een pipet. Voorzichtigheid moet worden gemaakt niet tot op de bodem substraat te raken, want het kan het axonale netwerk gevormd op de ondergrond beschadigen. Vervolgens worden 6700 oligodendrocyt cellen, verdund in 5 ul van cultuur media, toegevoegd aan de axon / glia compartimenten. Cellen worden geïncubeerd gedurende 1 uur en compartimenten zijn gevuld met cultuur media.
5. Cellen worden gekweekt bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO ₂ incubator en slechts de helft van de cultuur media is veranderd op om de 3-4 dagen voor twee weken.

Deel 5: representatieve resultaten:

Bij de experimenten correct worden uitgevoerd, neuron cellen geladen naar de soma compartiment vinden dicht bij microchannel inhammen en axonale laag beginnen te vormen binnen het axon / glia compartimenten na 1 week van de cultuur. Teken van neuron cel aggregatie in het soma compartiment kan een indicatie dat cellen niet gezond bent. Bij het laden van oligodendrocyten na twee weken van neuron cultuur, axon / glia compartimenten moeten worden gedekt met een dichte laag van de axonen en oligodendrocyten moeten worden geladen op de top van de axonale laag.

Figuur 1. Schematische afbeeldingen van de high-throughput microfluïdische meerdere compartimenten CNS neuron co-cultuur platform. Dwarsdoorsnede toont de isolatie van axonen van neuronale soma en dendrieten en vloeibare isolatie tussen de compartimenten met een minuut fluidisch niveau verschil. Gelieve Klik hier voor een grotere versie van figuur 1 te zien.

Figuur 2. Fabricage en assemblage stappen voor de meerdere compartimenten PDMS microfluïdische co-cultuur-apparaat. Elk apparaat past in een goed van een conventionele 6-well polystyreen celkweek plaat. Gelieve Klik hier voor een grotere versie van figuur 2 te zien.

Discussion

We hebben een multi-compartimenten co-cultuur platform voor het bestuderen van zoogdieren CNS axon-glia interactie. CNS axonen werden met succes geïsoleerd van neuronale cellichamen / dendrieten, en oligodendrocyten werden met succes samen gekweekt in het apparaat. Neuron dichtheid kan worden gevarieerd door toepassingen, maar te laag of te hoge concentratie kan leiden tot afsterven. Ook is het belangrijk om te veranderen maar de helft van de cultuur media, zodat de cellen of axonale laag op het substraat niet worden beschadigd. We verwachten dat dit systeem zal een krachtig instrument voor het bestuderen van CNS axon-glia signaalnetwerken in vitro worden en zorgen voor een pad in de richting van een high-throughput screening platform voor groeifactoren of potentiële kandidaat-geneesmiddelen die myelinisatie en myelineherstel te bevorderen.