Summary
De Stemgent Dox Induceerbare Mouse TF lentivirus Set kan herprogrammeren muis embryonale fibroblasten (MEF) om geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen. Hier hebben we het protocol voor DOX-induceerbare expressie van muis herprogrammering transcriptiefactoren Oct4 te tonen, om Sox2, Klf4 en c-Myc genereren iPS kolonies die uitdrukken gemeenschappelijke MES pluripotentie markers.
Abstract
Met behulp van een gedefinieerde set van transcriptiefactoren en celcultuur condities, Yamanaka en zijn collega's toonden aan dat retrovirus-gemedieerde levering en expressie van Oct4, Sox2, c-Myc en Klf4 in staat is om pluripotentie in muis fibroblasten. 1 Latere rapporten hebben aangetoond dat het nut van de doxycycline (DOX) induceerbaar lentivirale levering systeem voor het genereren van zowel de primaire en secundaire iPS cellen van een verscheidenheid van andere volwassen muis somatische celtypen. 2,3
Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen zijn vergelijkbaar met embryonale stamcellen (ES) cellen in morfologie, verspreiding en het vermogen om teratoom vorming induceren. Beide typen cellen kunnen worden gebruikt als de pluripotente uitgangsmateriaal voor de productie van gedifferentieerde cellen of weefsels in regeneratieve geneeskunde. 4-6 iPS cellen ook een duidelijk voordeel ten opzichte van ES-cellen hebben als ze vertonen de belangrijkste eigenschappen van embryonale stamcellen, zonder het ethische dilemma van embryo vernietiging.
Hier laten we zien het protocol voor herprogrammering muis embryonale fibroblasten (MEF) cellen met het Stemgent DOX Induceerbare Mouse TF lentivirus Set. We hebben ook laten zien dat de Stemgent DOX Induceerbare Mouse TF lentivirus Set is in staat om uit te drukken elk van de vier transcriptiefactoren bij de transductie in MEFs en veroorzaakt daardoor een pluripotente stamcellen staat dat de pluripotentie markers kenmerk van ES-cellen weergegeven.
Protocol
Discussion
Deze resultaten tonen aan dat de Stemgent DOX Induceerbare Mouse TF lentivirus Set kan worden gebruikt om efficiënt te genereren iPS kolonies door het induceren van de ectopische expressie van transcriptiefactoren getransduceerd in muis embryonale fibroblasten. Bij het ontwerpen van herprogrammering experimenten moet met een aantal variabelen worden beschouwd als de efficiëntie van de herprogrammering te optimaliseren. Ten eerste is het mogelijk om het actieve virus-to-target cel ratio (dat wil zeggen MOI) te wijzigen tijdens de primaire infectie stap te verhogen of verlagen van de transductie-efficiëntie, zulks afbreuk doet aan het aantal geïntegreerde virussen in de doelcel bevolking. Ten tweede kan het aanpassen van de lengte van tijd dat de cellen worden blootgesteld aan DOX invloed op de efficiëntie van de iPS cel kolonie generatie. Ten derde kan de proliferatieve capaciteit van de doelwitcellen invloed herprogrammering, als cellen die actief groeien en te delen zijn meer vatbaar voor herprogrammering. Ten slotte, bij de wijziging van het protocol voor de verschillende cellen nummers of verschillende grootte weefselkweek gerechten, wordt aanbevolen dat de doelcel nummers proportioneel worden aangepast aan de oppervlakte van de cultuur schotel.
Disclosures
De auteur, Brad Hamilton, in dienst is van Stemgent dat de reagentia en instrumenten gebruikt in dit artikel oplevert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DOX Inducible Mouse TF Concentrated Lentifirus Set | Stemgent | 00-0003 |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Aoi, T., Yae, K., Nakagawa, M., Ichisaka, T., Okita, K., Takahashi, K., Chiba, T., Yamanaka, S. Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells. Science. 321, 699-702 (2008).
- Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., Antosiewicz-Bourget, J., Frane, J. L., Tian, S., Nie, J., Jonsdottir, G. A., Ruotti, V., Stewart, R., Slukvin, I. I., Thomson, J. A. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132, 661-680 (2008).
- Lerou, P. H., Daley, G. Q. Therapeutic potential of embryonic stem cells. Blood Rev. 19, 321-331 (2005).
- Wernig, M., Meissner, A., Foreman, R., Brambrink, T., Ku, M., Hochedlinger, K., Bernstein, B. E., Jaenisch, R. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448, 318-324 (2007).
