Génération de cellules souches pluripotentes induites par la reprogrammation des fibroblastes embryonnaires de souris avec un facteur de transcription Quatre, doxycycline inductible système de transduction lentiviraux

Summary

Inductible Stemgent Dox souris Lentivirus TF Set peut reprogrammer des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) pour souches pluripotentes induites (iPS). Ici nous démontrons le protocole de DOX-expression inductible de facteurs de transcription de souris reprogrammation Oct4, Sox2, Klf4 et c-Myc pour générer des colonies iPS qui expriment des marqueurs communs MES pluripotence.

Abstract

L'utilisation d'un ensemble défini de facteurs de transcription et de conditions de culture cellulaire, Yamanaka et ses collègues ont démontré que des rétrovirus médiation de livraison et d'expression de Oct4, Sox2, c-Myc et Klf4 est capable d'induire la pluripotence dans des fibroblastes de souris. ¹ Des rapports subséquents ont démontré l'utilité de la doxycycline (DOX) inductible système de livraison lentiviral pour la génération de cellules iPS fois primaire et secondaire d'une variété d'autres types de souris cellule somatique adulte ^2,3.

Souches pluripotentes induites (iPS) sont similaires à souches embryonnaires (ES) cellules de morphologie, de la prolifération et la capacité d'induire la formation de tératome. Les deux types de cellules peuvent être utilisés comme matériau de départ pluripotentes pour la génération de cellules différenciées ou de tissus en médecine régénérative. ^4-6 cellules iPS ont également un net avantage sur les cellules ES comme ils présentent des propriétés clés des cellules ES sans le dilemme éthique la destruction d'embryons.

Ici nous démontrons le protocole pour la reprogrammation des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF), les cellules avec la souris inductibles DOX Stemgent Set TF lentivirus. Nous démontrons également que le inductible Stemgent DOX souris Lentivirus TF Set est capable d'exprimer chacun des quatre facteurs de transcription à la transduction dans MEFs induisant un état de cellules souches pluripotentes qui affiche les marqueurs de pluripotence caractéristiques des cellules ES.

Protocol

Discussion

Ces résultats démontrent que les souris inductibles Stemgent DOX Lentivirus Set TF peut être utilisé pour générer efficacement des colonies iPS en induisant l'expression ectopique de transduction des facteurs de transcription dans les fibroblastes embryonnaires de souris. Lors de la conception des expériences de reprogrammation, plusieurs variables doivent être considérés afin d'optimiser l'efficacité de la reprogrammation. Premièrement, il est possible de modifier le ratio de la cellule active du virus à cibler (c'est à dire MOI) pendant l'étape de l'infection primaire pour augmenter ou diminuer l'efficacité de transduction, affectant ainsi le nombre de virus intégré dans la population de cellules cibles. Deuxièmement, en ajustant la longueur de temps les cellules sont exposées à DOX peut affecter l'efficacité de la production d'iPS colonie cellulaire. Troisièmement, la capacité proliférative des cellules cibles peuvent avoir un impact reprogrammation, comme les cellules qui sont en pleine croissance et en divisant se prêtent davantage à une reprogrammation. Enfin, lors de la modification du protocole pour le nombre de cellules différentes ou différents plats de taille de culture de tissu, il est recommandé que le nombre de cellules cibles être ajustée proportionnellement à la surface de la boîte de culture.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DOX Inducible Mouse TF Concentrated Lentifirus Set	Stemgent	00-0003