Overview
यह वीडियो एक 3 डी तहखाने झिल्ली प्रोटीन मैट्रिक्स में स्तन कैंसर की कोशिकाओं को विकसित करने के लिए एक विस्तृत पद्धति प्रदान करता है, जो आसपास के वातावरण में सेल आक्रमण के आकलन में 3 डी संस्कृति की क्षमता का उदाहरण देता है।
Protocol
1. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में स्तन कैंसर कोशिकाओं की त्रि-आयामी संस्कृति (एम्बेडमेंट तकनीक)
- मैट्रिक्स तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स हैंडलिंग: 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर बर्फ पर गल। तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स कम तापमान पर तरल है, लेकिन कमरे के तापमान पर जमना । बर्फ पर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स रखें(आंकड़े 1A-B)।
- एक सर्पिल पैटर्न (चित्रा 1C)में एक पी-200 पिप्टमैन की नोक का उपयोग करके मैट्रिक्स फैलाने के माध्यम से बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स के 50 माइक्रोन के साथ कॉन्फोकल नंबर 1 ग्लास-बॉटम डिश को कवर करें। हवा के बुलबुले के गठन से बचने के लिए तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स फैलते समय सावधानी बरतें। इसी तरह, मेनिस्कस गठन को रोकने के लिए ग्लास-बॉटम डिश की सीमाओं के करीब मैट्रिक्स फैलाने से बचें। यदि अनुभवहीन हैंडलिंग तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स, तो पकवान precooled, पी-२०० Pipetman और pipettes बर्फ पर हो सकता है (वैकल्पिक रूप से 4 डिग्री सेल्सियस पर एक फ्रिज में रात भर छोड़ दिया) । यह चरण ठोसकरण से पहले तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को फैलाने के लिए अतिरिक्त समय प्रदान करता है। बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स को जमना(चित्रा 1D)को सक्षम करने के लिए कम से कम 30 मिनट के लिए एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर (5% CO2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर) में डिश (es) रखें।
- जबकि मैट्रिक्स जमना के दौर से गुजर रहा है, कोशिकाओं की एक 70-80% विन्यास 100-मिमी प्लेट की कोशिश। एक बार कोशिकाओं को थाली से उठा शुरू कर दिया है, उन्हें RPMI 1640 माध्यम के 10 मिलीलीटर में फिर से खर्च 10% (v/v) भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) युक्त, trypsin (चित्रा 1E) निष्क्रिय करने के लिए. फिर पुनर्नैरित कोशिकाओं को 15 मिलीलीटर शंकु नली(चित्रा 1F)में स्थानांतरित करें।
- कोशिकाओं (शंकु नली में मौजूद) एक समर्पित सेल संस्कृति अपकेंद्रित्र(आंकड़े 1G-H)में 3 मिनट के लिए १०० x ग्राम पर स्पिन ।
- जबकि कोशिकाओं को नीचे घूमती जा रही है, एक 1 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में मैट्रिक्स के ५० माइक्रोल (नोट: प्रत्येक ग्लास-तली डिश को एक माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब आवंटित किया जाता है; इसलिए, यदि प्रयोग के लिए 3 व्यंजनों की आवश्यकता होती है, तो यह इस प्रकार है कि 3 माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब आवश्यक हैं), और फिर ट्यूब को बर्फ(चित्रा 1B)पर रखें।
- चरण 1.4 से शंकु नली से माध्यम को एस्पिरेट करें, जबकि गोली को अव्यवस्थित(चित्रा 1I)छोड़ दें। एफबीएस-पूरक आरपीएमआई माध्यम(चित्रा 1J)के 1 मिलीलीटर में 1 मिलीलीटर कोशिकाओं (जो नीचे घूमती हुई हैं) को फिर से पेंड करें।
- एक बार कोशिकाओं को एक हीमोसाइटोमीटर (चित्रा 1K) का उपयोग करके गिना जाता है, या एक सेल कण काउंटर एलिकोट 2.5 x 104 कोशिकाओं को माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में और उचित मीडिया का उपयोग करके इसे ऊपर कर देता है ताकि 50 माइक्रोल(चित्रा 1L)की कुल मात्रा प्राप्त की जा सके।
- एक 1:1 अनुपात में चरण 1.5 से मैट्रिक्स युक्त माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब के साथ चरण 1.7 (50 माइक्रोल में 25,000 कोशिकाओं) से कोशिकाओं को मिलाएं; अंतिम मात्रा 100 माइक्रोन(चित्रा 1M)होगी।
- धीरे-धीरे मैट्रिक्स के 100 माइक्रोन प्लेट: चरण 1.8 से सेल मिश्रण स्टेप 1.2(चित्रा 1N)से जम तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित पकवान पर। यह कोशिकाओं को तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में एम्बेडेड करने की अनुमति देता है।
- डिश (es) को सेल कल्चर इनक्यूबेटर (5% CO2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर) में स्थानांतरित करें और मैट्रिक्स: सेल मिश्रण को कम से कम 30 मिनट के लिए जमना की अनुमति दें।
- एक बार मैट्रिक्स: सेल मिश्रण जम जाता है, तो डिश(चित्रा 1O)में 2 मिलीलीटर एफबीएस-पूरक आरपीएमआई मीडिया जोड़ें और डिश को इनक्यूबेटर वापस लें जहां इसे शेष प्रयोग(चित्रा 1P)के लिए संग्रहीत किया जाएगा।
- 5 दिनों की अवधि के लिए हर दिन मीडिया बदलें (या परख के लिए आवश्यक के अनुसार; एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं के लिए परख की अवधि 5 दिन की लंबाई है)।
- एक हल्के माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, एमडीए-एमबी-231 बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स(चित्रा2 ए) में निलंबित कालोनियों के अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) छवियां लें। इमेज 20 उद्देश्य पर 10X उद्देश्य पांच दिनों के लिए एक दिन में एक बार कॉलोनी मॉर्फोजेनेसिस(चित्रा 2C)का निर्धारण करने के लिए ।
- सेल कॉलोनी स्टेलेट गठन(चित्रा 2B)निर्धारित करने के लिए आंख बंद करके छवियों का विश्लेषण करें। यदि कोशिकाओं के गोलाकार से एक या अधिक अनुमानों को माना जाता है तो एक उपनिवेश को तारकीय माना जाता है। आक्रामक स्टेलेट उपनिवेशों के प्रतिशत को निर्धारित करने के लिए, प्रति अधिग्रहीत छवि सेल उपनिवेशों की कुल संख्या से स्टेलेट कॉलोनियों की संख्या को विभाजित करें, और फिर प्रत्येक दिन के लिए 20 छवियों के स्टेलेट कॉलोनियों प्रतिशत को औसत दें।
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Representative Results
चित्रा 1. एमडीए की त्रि-आयामी संस्कृति- एमबी-231 स्तन कैंसर कोशिकाओं में बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स (एम्बेडमेंट तकनीक)। ए-बी) प्रायोगिक सेटअप का एक योजनाबद्ध (धूम हुड में किया जाता है)। ग) ग्लास तली पकवान का कुआं तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के ५० माइक्रोन के साथ लेपित । घ) डिश (es) एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में रखा (5% CO2 के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर) मैट्रिक्स की अनुमति के लिए कम से 30 मिनट ई के लिए जमना) कोशिकाओं की कोशिश की गई । एफ) कोशिकाओं को 15 मिलीलीटर शंकु नली में फिर से निलंबित कर दिया गया था। जी-एच) कोशिकाओं (शंकु नली में मौजूद) एक ऊतक संस्कृति अपकेंद्रित्र में 3 मिनट के लिए १०० x ग्राम पर नीचे घूमती थी । I) सेल पेलेट। जम्मू) कोशिकाओं (कि नीचे घूमती है) FBS के 1 मिलीलीटर में फिर से निलंबित कर दिया गया-RPMI माध्यम पूरक । कश्मीर) कोशिकाओं को एक हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके गिना जाता था। एल) 2.5 x 104 कोशिकाओं को माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में उद्धृत किया गया और उपयुक्त मीडिया का उपयोग करके सबसे ऊपर रखा गया ताकि 50 माइक्रोल की कुल मात्रा प्राप्त की जा सके। एम) 1:1 अनुपात में चरण 1.5 से मैट्रिक्स युक्त माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब के साथ चरण 1.7 (50 माइक्रोल में 25,000 कोशिकाओं) से कोशिकाओं को मिलाएं; अंतिम मात्रा 100 माइक्रोन होगी। N) धीरे-धीरे मैट्रिक्स के 100 माइक्रोन प्लेट: चरण 1.2 से जम मैट्रिक्स-लेपित पकवान पर स्टेप 8 से सेल मिश्रण। O) एक बार मैट्रिक्स: सेल मिश्रण जम जाता है, डिश के लिए FBS-पूरक RPMI मीडिया के 2 मिलीलीटर जोड़ें । पी) डिश को इनक्यूबेटर में रखें जहां इसे प्रयोग के शेष के लिए संग्रहीत किया जाएगा ।
चित्रा 2। छवि अधिग्रहण और प्रतिनिधि छवियों का चित्रण। ए) माइक्रोस्कोप के साथ ली गई छवियां । B) अंतर हस्तक्षेप कंट्रास्ट (डीआईसी) इमेजिंग माइक्रोस्कोप छवियों को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया और बाद में छवियों छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण किया । ग) एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं के नमूना प्रतिनिधि डीआईसी छवियां (पांच दिनों के लिए दिन में एक बार ली गई) दिखाई जाती हैं। एक तरह से ANOVA है Dunnett कई तुलना परीक्षण के बाद: *, पी & ०.०५ । स्केल बार, 100 माइक्रोन।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35-mm glass-bottomed Confocal No.1 culture dishes | MatTek Corporation | P35G-1.0-14-C | Precooled before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB003.100 | Used at 3% for IF |
| 1.5 ml tubes | VWR | CA10011-700 | CA10011-700 |
| 100-mm culture dish BD353003 | VWR | CABD353003 | Sterile, disposable |
| 15 ml Falcon tube | VWR | CA21008-918 | Sterile, disposable |
| 1 ml filtered tips | VWR | 10011-350 | Sterile, disposable |
| 200 μl filtered tips | VWR | 22234-016 | Sterile, disposable |
| 20 μl filtered tips | VWR | 22234-008 | Sterile, disposable |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F1051 | Used at 10% (v/v) |
| RPMI 1640 Medium with Glutamine | Life Technologies | 11875-119 | Used for culturing of MDA-MB-231 cells |
| MEGM (bullet kit): MEBM (CC3151)+Single quots (CC4136) | Lonza | CC-3150 | Used for culturing of MCF10A cells |
| Olympus IX-81 microscope | Olympus | Used for 3D culture imaging (DIC images at 10X and 40X) |
