Encyclopedia of Experiments: Cancer Research
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सबसे पहले, एक ग्लास-बॉटम डिश में ठंडे तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स डालें और इसे एक पिपेट टिप के साथ समान रूप से फैलाएं। झिल्ली को कार्बन डाइऑक्साइड की निरंतर आपूर्ति के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर जमना चाहिए। फ्लोरोसेंटली-लेबल वाले कैंसर कोशिकाओं को प्लेट की सतह से अलग करने और उन्हें संस्कृति माध्यम में फिर से खर्च करने के लिए ट्रिप्सिनाइज करें।
इन पुनर्नसंबंधित कोशिकाओं को शंकु नली और स्पिन में स्थानांतरित करें। सुपरनेट निकालें और कोशिकाओं को संस्कृति माध्यम में फिर से व्यतीत करें। गिनती के बाद, इस कोशिका निलंबन को मिलाएं जिसमें तहखाने मैट्रिक्स के साथ कोशिकाओं की वांछित संख्या समान अनुपात में होती है।
धीरे-धीरे जम तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित पकवान पर सेल मैट्रिक्स मिश्रण प्लेट। सेल मैट्रिक्स मिश्रण कार्बन डाइऑक्साइड की एक निरंतर आपूर्ति के साथ, 37 डिग्री सेल्सियस पर जमना करते हैं। एक बार मिश्रण जम जाता है, पकवान के लिए संस्कृति माध्यम जोड़ें और यह वांछित अवधि के लिए इनक्यूबेट ।
कैंसर कोशिकाएं ऐक्टिन-रिच झिल्ली फलाव बन सकती हैं, और एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स को नीचा दिखाने के लिए प्रोटीज जारी कर सकती हैं, इस प्रकार मैट्रिक्स पर हमला कर सकती हैं। फलाव बनाने वाली कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए अलग-अलग समय अंतराल पर डिश को फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के नीचे रखें। उदाहरण प्रोटोकॉल में, हम आक्रमण प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए 3 डी बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स पर स्तन कैंसर कोशिकाओं को संस्कृति देंगे।
संस्कृति प्रक्रिया शुरू करने से पहले, तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स, एक P200 पिपेट और बर्फ पर पिपेट युक्तियां, 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें । अगले दिन, एक कॉन्फोकल नंबर 1 ग्लास-बॉटम डिश के नीचे सर्पिल पैटर्न में मैट्रिक्स के 50 माइक्रोलीटर फैलाने के लिए बर्फ-ठंड 200-माइक्रोलीटर पिपेट की नोक का उपयोग करें। फिर डिश को सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें, 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ, कम से कम 30 मिनट के लिए।
जबकि मैट्रिक्स जमना के दौर से गुजर रहा है, कोशिकाओं की एक 70% से 80% के लिए 100 मिलीमीटर प्लेट की कोशिश। एक बार कोशिकाओं को अलग करने के लिए शुरू कर दिया है, माध्यम के 10 मिलीलीटर के साथ ट्रिप्सिन निष्क्रिय और फिर एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में सेल निलंबन हस्तांतरण ।
100 जीएस और 4 डिग्री सेल्सियस पर तीन मिनट के लिए कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र। जबकि कोशिकाओं को नीचे कताई कर रहे हैं, एलिकोट ५० मैट्रिक्स के माइक्रोलीटर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के पकवान प्रति १ मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में और बर्फ पर ट्यूब जगह है । जब कोशिकाएं कताई समाप्त हो जाती हैं, तो गोली को परेशान किए बिना सुपरनेट को एस्पिरेट करें और फिर कोशिकाओं को मीडिया के 1 मिलीलीटर में फिर से खर्च करें और उन्हें गिनें।
इसके बाद, 4 कोशिकाओं को 2.5 गुना 10 को एक नई माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, मीडिया के साथ सेल निलंबन को 50 माइक्रोलीटर की अंतिम मात्रा में टॉपिंग करें। फिर 100 माइक्रोलीटर की अंतिम मात्रा के लिए, 1:1 अनुपात में कोशिकाओं में बर्फ ठंडे तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें। धीरे-धीरे मैट्रिक्स को जमने वाले तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स पर सेल मिश्रण में प्लेट करें और कोशिकाओं को कोशिका संस्कृति इनक्यूबेटर में मैट्रिक्स में एम्बेडेड बनने की अनुमति दें।
30 मिनट के बाद, मैट्रिक्स को मीडिया के 2 मिलीलीटर के साथ कवर करें, और प्रयोग की अवधि के लिए हर दिन मीडिया को बदलते हुए पकवान को इनक्यूबेटर में वापस रखें। तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में निलंबित कॉलोनी के 20 अंतर हस्तक्षेप विपरीत छवियों को लेने के लिए प्रयोग की अवधि के लिए हर दिन एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के 10x उद्देश्य का उपयोग करें। सेल कॉलोनी स्टेलेट गठन निर्धारित करने के लिए आंख बंद करके छवियों का विश्लेषण करें। यदि कोशिकाओं के गोलाकार से एक या अधिक अनुमानों को देखा जाता है तो एक उपनिवेश को तारकीय माना जाता है।
