3D-cultuur keldermembraantest: cultiveren van kankercellen op 3D-keldermembraaneiwitmatrix om celinvasie te bestuderen

Giet eerst koude keldermembraanmatrix in een schotel met glazen bodem en verdeel deze gelijkmatig met een pipetpunt. Laat het membraan stollen bij 37 graden Celsius, met een continue toevoer van kooldioxide. Probeer de fluorescerend gelabelde kankercellen te verkleinen om ze los te maken van het plaatoppervlak en ze opnieuw te gebruiken in een kweekmedium.

Breng deze geresuspendeerde cellen over in een conische buis en draai. Verwijder het supernatant en resuspend de cellen in het kweekmedium. Meng na het tellen deze celsuspensie met het gewenste aantal cellen met de keldermatrix in een gelijke verhouding.

Leg het celmatrixmengsel voorzichtig op de gestolde keldermembraanmatrix-gecoate schaal. Laat het celmatrixmengsel stollen bij 37 graden Celsius, met een continue toevoer van kooldioxide. Zodra het mengsel stolt, voeg je kweekmedium toe aan het gerecht en incubeer je het gedurende de gewenste periode.

Kankercellen kunnen actinerijke membraanuitsteeksels vormen en proteasen vrijgeven om de extracellulaire matrix af te doen en zo de matrix binnen te dringen. Plaats de schotel met verschillende tijdsintervallen onder een fluorescerende microscoop om de cellen die uitsteeksels vormen te analyseren. In het voorbeeldprotocol zullen we borstkankercellen gekweekt op een 3D-keldermembraanmatrix om het invasieproces te bestuderen.

Voordat u met de kweekprocedure begint, plaatst u de keldermembraanmatrix, een P200-pipet en pipetpunten 's nachts op ijs, op 4 graden Celsius. Gebruik de volgende dag het topje van de ijskoude pipet van 200 microliter om 50 microliter van de matrix in een spiraalpatroon over de bodem van een confocale schotel met nummer 1 glazen bodem te verspreiden. Plaats het gerecht vervolgens minstens 30 minuten in een celkweek-incubator op 37 graden Celsius, met 5% kooldioxide.

Terwijl de matrix stolling ondergaat, trypsinize een 70% tot 80% samenvloeiende 100 millimeter plaat van cellen. Zodra de cellen zijn begonnen los te maken, inactiveer de trypsine met 10 milliliter medium en breng vervolgens de celsuspensie over in een conische buis van 15 milliliter.

Centrifugeer de cellen gedurende drie minuten op 100 Gs en 4 graden Celsius. Terwijl de cellen naar beneden draaien, aliquot 50 microliter matrix in een 1 milliliter microcentrifuge buis per schotel van kelder membraan matrix en plaats de buizen op ijs. Wanneer de cellen klaar zijn met spinnen, aspireer je het supernatant zonder de pellet te verstoren en resuspendeer je de cellen vervolgens in 1 milliliter media en tel je ze.

Breng vervolgens 2,5 keer 10 over naar de 4e cellen in een nieuwe microcentrifugebuis, waarbij de celsuspensie met media wordt afgemaakt tot een eindvolume van 50 microliters. Voeg vervolgens de 50 microliters ijskoude keldermembraanmatrix toe aan de cellen in een verhouding van 1:1, voor een eindvolume van 100 microliters. Leg het matrix-naar-celmengsel voorzichtig op de gestolde keldermembraanmatrix en laat de cellen in de matrix in de celkweek-incubator worden ingebed.

Bedek na 30 minuten de matrix met 2 milliliter media en plaats de schaal terug in de incubator en verander de media elke dag voor de duur van het experiment. Gebruik de 10x doelstelling van een lichtmicroscoop eenmaal per dag voor de duur van het experiment om 20 differentiële interferentiecontrastbeelden te maken van de kolonie die in de keldermembraanmatrix hangt. Analyseer de beelden blindelings om de stellate vorming van de celkolonie te bepalen. Een kolonie wordt als stellaat beschouwd als een of meer projecties van de sferoïde van cellen worden waargenomen.