3D-Kultur-Keller-Membran-Assay: Kultivieren von Krebszellen auf 3D Basement Membrane Protein Matrix zur Untersuchung der Zellinvasion

Zuerst kalte Kellermembranmatrix in eine Glasbodenschale gießen und gleichmäßig mit einer Pipettenspitze verteilen. Lassen Sie die Membran bei 37 Grad Celsius erstarren, mit einer kontinuierlichen Versorgung mit Kohlendioxid. Versuchen Sie, die fluoreszierend markierten Krebszellen zu verkleinern, um sie von der Plattenoberfläche zu lösen und sie in einem Kulturmedium wieder aufzuhängen.

Übertragen Sie diese resuspendierten Zellen in ein konisches Rohr und drehen Sie. Entfernen Sie den Überstand, und setzen Sie die Zellen im Kulturmedium wieder aus. Mischen Sie nach dem Zählen diese Zellsuspension, die die gewünschte Anzahl von Zellen enthält, mit der Kellermatrix im gleichen Verhältnis.

Die Zellmatrixmischung vorsichtig auf die erstarrte, mit Kellermembran matrixbeschichtete Schale auftragen. Lassen Sie das Zellmatrixgemisch bei 37 Grad Celsius erstarren, mit einer kontinuierlichen Versorgung mit Kohlendioxid. Sobald die Mischung erstarrt, fügen Sie Kulturmedium auf das Gericht und inkubieren Sie es für den gewünschten Zeitraum.

Krebszellen können aktinreiche Membranvorsprünge bilden und Proteasen freisetzen, um die extrazelluläre Matrix zu degradieren und so in die Matrix einzudringen. Platzieren Sie die Schale in verschiedenen Zeitintervallen unter ein Fluoreszenzmikroskop, um die Zellen zu analysieren, die Vorsprünge bilden. Im Beispielprotokoll werden wir Brustkrebszellen auf einer 3D-Kellermembranmatrix kulturieren, um den Invasionsprozess zu untersuchen.

Bevor Sie mit dem Kulturverfahren beginnen, legen Sie die Kellermembranmatrix, eine P200 Pipette und Pipettenspitzen über Nacht bei 4 Grad Celsius auf Eis. Am nächsten Tag verwenden Sie die Spitze der eiskalten 200-Mikroliter-Pipette, um 50 Mikroliter der Matrix in einem Spiralmuster über den Boden einer konfokalen Glasbodenschale Nummer 1 zu verteilen. Dann legen Sie das Gericht in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius, mit 5% Kohlendioxid, für mindestens 30 Minuten.

Während die Matrix erstarrt wird, versuchen Sie eine 70% bis 80% konfluente 100-Millimeter-Platte von Zellen. Sobald die Zellen begonnen haben, sich zu lösen, inaktivieren Sie das Trypsin mit 10 Milliliter n. Medium und übertragen Sie dann die Zellsuspension in ein 15-Milliliter konisches Rohr.

Zentrifugieren Sie die Zellen für drei Minuten bei 100 Gs und 4 Grad Celsius. Während sich die Zellen nach unten drehen, aliquotieren 50 Mikroliter Matrix in einem 1 Milliliter Mikrozentrifugenrohr pro Schale Kellermembranmatrix und legen Sie die Röhren auf Eis. Wenn die Zellen mit dem Spinnen fertig sind, aspirieren Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören, und suspendieren Sie die Zellen dann in 1 Milliliter Medien und zählen Sie sie.

Als nächstes übertragen Sie 2,5 mal 10 in die 4. Zellen in ein neues Mikrozentrifugenrohr, das die Zellsuspension mit Medien auf ein Endvolumen von 50 Mikrolitern abrundet. Dann fügen Sie die 50 Mikroliter eiskalte Kellermembranmatrix zu den Zellen im Verhältnis 1:1 hinzu, für ein Endvolumen von 100 Mikrolitern. Die Matrix vorsichtig auf die verfestigte Kellermembranmatrix zu zelliorieren und die Zellen in die Matrix im Zellkultur-Inkubator einbetten zu lassen.

Nach 30 Minuten die Matrix mit 2 Millilitern Medien bedecken und die Schale wieder in den Inkubator legen, wobei die Medien für die Dauer des Experiments täglich gewechselt werden. Verwenden Sie das 10-fache Objektiv eines Lichtmikroskops einmal täglich für die Dauer des Experiments, um 20 Differentialinterferenzkontrastbilder der Kolonie aufzunehmen, die in der Kellermembranmatrix schweben. Analysieren Sie die Bilder blind, um die stellate Zellkoloniebildung zu bestimmen. Eine Kolonie gilt als stellatiert, wenn eine oder mehrere Projektionen aus dem Sphäroid der Zellen beobachtet werden.