Test della membrana basale della coltura 3D: coltivare le cellule tumorali sulla matrice proteica della membrana basale 3D per studiare l'invasione cellulare

In primo luogo, versare la matrice a membrana del seminterrato freddo in un piatto con fondo di vetro e stenderla uniformemente con una punta di pipetta. Lasciare che la membrana si solidifichi a 37 gradi Celsius, con un apporto continuo di anidride carbonica. Tripinare le cellule tumorali etichettate fluorescentmente per staccarle dalla superficie della piastra e rimostrarle in un mezzo di coltura.

Trasferire queste cellule rimorsi in un tubo conico e girare. Rimuovere il supernatante e rimescolare le celle nel supporto di coltura. Dopo il conteggio, mescolare questa sospensione cellulare contenente il numero desiderato di celle con la matrice del seminterrato in un rapporto uguale.

Placcare delicatamente la miscela di matrice cellulare sul piatto rivestito con matrice di membrana basale solidificata. Lasciare che la miscela di matrice cellulare si solidifichi a 37 gradi Celsius, con un apporto continuo di anidride carbonica. Una volta che la miscela si solidifica, aggiungere il terreno di coltura al piatto e incubarlo per il periodo desiderato.

Le cellule tumorali possono formare sporgenze di membrana ricche di actina e rilasciare proteasi per degradare la matrice extracellulare, invadendo così la matrice. Posizionare il piatto al microscopio fluorescente a diversi intervalli di tempo per analizzare le cellule che formano sporgenze. Nel protocollo di esempio, coltireremo le cellule tumorali del seno su una matrice di membrana basale 3D per studiare il processo di invasione.

Prima di iniziare la procedura di coltura, posizionare la matrice della membrana basale, una pipetta P200 e punte di pipetta sul ghiaccio durante la notte, a 4 gradi Celsius. Il giorno successivo, utilizzare la punta della pipetta ghiacciata da 200 microlitri per distribuire 50 microlitri della matrice in un motivo a spirale sul fondo di un piatto con fondo di vetro confocale numero 1. Quindi mettere il piatto in un incubatore di coltura cellulare a 37 gradi Celsius, con 5% di anidride carbonica, per almeno 30 minuti.

Mentre la matrice è in fase di solidificazione, tripinare una piastra confluente da 100 millimetri di cellule confluente dal 70% all'80%. Una volta che le cellule hanno iniziato a staccarsi, inattivare la tripina con 10 millilitri di mezzo e quindi trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 millilitri.

Centrifugare le cellule per tre minuti a 100 G e 4 gradi Celsius. Mentre le cellule girano verso il basso, aliquota 50 microlitri di matrice in un tubo di microcentrifugo da 1 millilitro per piatto di matrice di membrana basale e posizionare i tubi sul ghiaccio. Quando le cellule hanno finito di girare, aspirare il supernatante senza disturbare il pellet e quindi rimescolare le cellule in 1 millilitro di supporto e contarle.

Successivamente, trasferire 2,5 per 10 alla 4a cella in un nuovo tubo di microcentrifugo, completando la sospensione cellulare con il supporto a un volume finale di 50 microlitri. Quindi aggiungere i 50 microlitri della matrice di membrana basale ghiacciata alle cellule con un rapporto 1:1, per un volume finale di 100 microlitri. Placcare delicatamente la miscela matrice-cella sulla matrice di membrana basale solidificata e consentire alle cellule di essere incorporate nella matrice nell'incubatore di coltura cellulare.

Dopo 30 minuti, coprire la matrice con 2 millilitri di supporto e riposizionare il piatto nell'incubatore, cambiando il supporto ogni giorno per tutta la durata dell'esperimento. Usa l'obiettivo 10x di un microscopio a luce una volta al giorno per tutta la durata dell'esperimento per scattare 20 immagini di contrasto di interferenza differenziale della colonia sospesa nella matrice della membrana del seminterrato. Analizza le immagini alla cieca per determinare la formazione stellata della colonia cellulare. Una colonia è considerata stellata se si osservano una o più proiezioni dallo sferoide delle cellule.