3D-kultur kjellermembrananalyse: Culturing kreftceller på 3D kjellermembran proteinmatrise for å studere celleinvasjon

Hell først kald kjellermembranmatrise i en glassbunnsfat og spre den jevnt med en pipettespiss. La membranen størkne ved 37 grader Celsius, med kontinuerlig tilførsel av karbondioksid. Prøv å unngå de fluorescerende merkede kreftcellene for å løsne dem fra plateoverflaten og resuspendere dem i et kulturmedium.

Overfør disse resuspenderte cellene til et konisk rør og spinn. Fjern supernatanten og resuspend cellene i kulturmediet. Etter telling blander du denne cellefjæringen som inneholder ønsket antall celler med kjellermatrisen i et likt forhold.

Legg cellematriseblandingen forsiktig på den størknede matrisebelagte parabolen i kjelleren. La cellematriseblandingen størkne ved 37 grader Celsius, med kontinuerlig tilførsel av karbondioksid. Når blandingen størkner, legg til kulturmedium til parabolen og inkuber den i ønsket periode.

Kreftceller kan danne aktinrike membranutstikk, og frigjøre proteaser for å forringe den ekstracellulære matrisen, og dermed invadere matrisen. Plasser parabolen under et fluorescerende mikroskop med forskjellige tidsintervaller for å analysere cellene som danner fremspring. I eksempelprotokollen vil vi dyrke brystkreftceller på en 3D kjellermembranmatrise for å studere invasjonsprosessen.

Før du begynner kulturprosedyren, plasser kjellermembranmatrisen, en P200 pipette og pipettespisser på is over natten, ved 4 grader Celsius. Neste dag, bruk spissen av den iskalde 200-mikroliterpipetten til å spre 50 mikroliter av matrisen i et spiralmønster over bunnen av en Confocal nummer 1 glassbunnsfat. Legg deretter parabolen i en cellekulturinkubator ved 37 grader Celsius, med 5% karbondioksid, i minst 30 minutter.

Mens matrisen gjennomgår størkning, prøver du en 70% til 80% konfluent 100 millimeter plate av celler. Når cellene har begynt å løsne, inaktiver trypsin med 10 milliliter medium og overfør deretter cellefjæringen til et 15 milliliter konisk rør.

Sentrifuger cellene i tre minutter ved 100 G og 4 grader Celsius. Mens cellene spinner ned, aliquot 50 mikroliter matrise i en 1 milliliter mikrocentrifuge rør per tallerken kjeller membran matrise og plassere rørene på is. Når cellene er ferdige med å spinne, aspirerer du supernatanten uten å forstyrre pelletsen og deretter gjenopplive cellene i 1 milliliter medier og telle dem.

Deretter overfører du 2,5 ganger 10 til fjerde celler til et nytt mikrosenterrør, og topper cellefjæringen med medier til et endelig volum på 50 mikroliter. Tilsett deretter de 50 mikroliter av iskald kjellermembranmatrise i cellene med et 1: 1-forhold, for et sluttvolum på 100 mikroliter. Legg forsiktig matrisen til celleblandingen på den størkne kjellermembranmatrisen og la cellene bli innebygd i matrisen i cellekulturinkubatoren.

Etter 30 minutter, dekk matrisen med 2 milliliter medier, og legg parabolen tilbake i inkubatoren, endre media hver dag i løpet av eksperimentet. Bruk 10x-målet med et lysmikroskop en gang hver dag i løpet av eksperimentet for å ta 20 differensialinterferenskontrastbilder av kolonien suspendert i kjellermembranmatrisen. Analyser bildene blindt for å bestemme cellekoloniens stellateformasjon. En koloni anses å være stellate hvis en eller flere projeksjoner fra sfæroiden av celler observeres.