3D Kultur Basement Membrane Assay: Culturing kræftceller på 3D Kælder Membran Protein Matrix at studere Cell Invasion

Overview

Denne video giver en detaljeret metode til at dyrke brystkræftceller i en 3D kælder membran protein matrix, eksemplificere potentialet i 3D-kultur i vurderingen af celleinvasion i det omgivende miljø.

Protocol

1. Tre-dimensionel kultur af brystkræftceller i Basement Membrane Matrix (Indlejringsteknikken)

1. Håndtering matrigel kælder membran matrix: Tø på is natten over ved 4 °C. Kældermembranmatrix er flydende ved lav temperatur, men størkner ved stuetemperatur. Hold kælderen membran matrix på is(Figur 1A-B).
2. Confocal No.1 glasbundsskålen dækkes med 50 μl kældermembranmatrix ved at sprede matrixen ved hjælp af spidsen af en P-200 Pipetman i et spiralmønster (Figur 1C). Vær forsigtig, når du spreder kældermembranmatrixen for at undgå dannelse af luftbobler. Ligeledes undgå at sprede matrixen til tæt på grænserne af glasbundsskålen for at forhindre meniskdannelse. Hvis der ikke er erfaring med håndtering af kældermembranmatrix, kan P-200 Pipetman og pipetter være på is (alternativt efterladt natten over i et køleskab ved 4 °C). Dette trin giver ekstra tid til at sprede kælderen membranmatrix før størkning. Skålen(e) anbringes i en cellekulturinkubator (ved 37 °C med 5% CO2) i mindst 30 minutter, så kældermembranmatrixen kan størkne (Figur 1D).
3. Mens matrixen er under størkning, trypsinize en 70-80% sammenflydende 100-mm plade af celler. Når cellerne er begyndt at løfte af pladen, genbruges dem i 10 ml RPMI 1640 medium indeholder 10% (v/ v) føtal kvæg serum (FBS), at inaktivere trypsin (Figur 1E). Derefter overføres de genanvendelige celler til et 15 ml konisk rør (Figur 1F).
4. Drej cellerne (til stede i konisk rør) ved 100 x g i 3 min i en dedikeret cellekulturcentrifuge (Figur 1G-H).
5. Mens cellerne spundet ned, aliquot 50 μl matrix i en 1 ml mikrocentrifuge rør (bemærk: hver glasbundet fad er tildelt en mikrocentrifuge rør, og dermed, hvis forsøget kræver 3 retter, så følger det, at 3 mikrocentrifuge rør er nødvendige så godt), og derefter placere røret på is (Figur 1B).
6. Mediet suges ud af konisk rør fra trin 1.4, samtidig med at pelleten ikke forstyrres (Figur 1I). Genanvendelige celler (som er blevet spundet ned) i 1 ml FBS-suppleret RPMI-medium (Figur 1J).
7. Når cellerne tælles ved hjælp af et hæmocytometer (figur 1K), eller en cellepartikeltæller aliquot 2,5 x 104 celler i mikrocentrifugerøret og topper det ved hjælp af passende medier for at opnå et samlet volumen på 50 μl (Figur 1L).
8. Cellerne blandes fra trin 1.7 (25.000 celler i 50 μl) med det matrixholdige mikrocentrifugerør fra trin 1.5 i forholdet 1:1. det endelige volumen vil være 100 μl (figur 1M).
9. Plade forsigtigt 100 μl af matrixen:celleblandingen fra trin 1.8 på den størknede kældermembranmatrixbelagte skål fra trin 1.2 (Figur 1N). Dette gør det muligt for celler at blive indlejret i kælderen membran matrix.
10. Skålene overføres til cellekulturinkubatoren (ved 37 °C med 5 % CO2), og matrix-celleblandingen størkner i mindst 30 min.
11. Når matrixen:celleblandingen er størknet, tilsættes 2 ml FBS-suppleret RPMI-medie til skålen (Figur 1O), og skålen føres tilbage til inkubatoren, hvor den opbevares i resten af forsøget (figur 1P).
12. Skift medie hver dag i en periode på 5 dage (eller som pr kræves for en analyse; varigheden af analysen for MDA-MB-231 celler er 5 dage i længden).
13. Brug et let mikroskop til at tage DIC-billeder (differentialinterferenskontrast) af MDA-MB-231-kolonierne, der er ophængt i kældermembranmatrix(Figur 2A). Billede 20 repræsentative områder på 10X mål en gang om dagen i fem dage for at bestemme koloni morfogenese (Figur 2C).
14. Analyser billeder blindt for at bestemme cellekoloniens stjernedannelse (Figur 2B). En koloni anses for at være stjerne, hvis en eller flere fremskrivninger fra sfæroid af celler opfattes. Hvis du vil bestemme procentdelen af invasive stjernekolonier, skal du dividere antallet af stjernekolonier med det samlede antal cellekolonier pr. erhvervet billede og derefter beregne gennemsnittet af stjernernes koloniprocenter af de 20 billeder for hver dag.

Representative Results

Figur 1. Tredimensionel kultur af MDA-MB-231 brystkræftceller i kælderen membran matrix (indlejring teknik). A-B) En skematisk af den eksperimentelle opsætning (udført i røghætten). C) Brønden på den glasbundede skål belagt med 50 μl kældermembranmatrix. D) Skåle placeret i en cellekulturinkubator (ved 37 °C med 5% CO2) for at gøre det muligt for matrixen at størkne i mindst 30 min. E) Celler blev afprøvet. F) Cellerne blev genbrugt til et 15 ml konisk rør. G-H) Celler (til stede i konisk rør) blev spundet ned på 100 x g i 3 min i en vævskultur centrifuge. I) Cellepille. J) Celler (der er blevet spundet ned) blev genbrugt i 1 ml FBS-suppleret RPMI medium. K) Celler blev talt ved hjælp af et hæmocytometer. L) 2,5 x 104 celler, der er indslæbt i mikrocentrifugerøret og toppet med passende medier for at opnå et samlet volumen på 50 μl. M) Bland celler fra trin 1.7 (25.000 celler i 50 μl) med det matrixholdige mikrocentrifugerør fra trin 1.5 i et 1:1-forhold; det endelige volumen vil være 100 μl. N) Forsigtigt plade 100 μl af matrixen: celleblanding fra trin 8 på den størknede matrixbelagte skål fra trin 1.2. O) Når matrix:celleblandingen er størknet, tilsættes 2 ml FBS-suppleret RPMI-medie til skålen. P) Placer skålen i inkubatoren, hvor den vil blive opbevaret i resten af forsøget.

Figur 2. Billederhvervelse og illustration af repræsentative billeder. A) Billeder taget med et mikroskop. B) Differential interferenskontrast (DIC) billedmikroskop, der bruges til at erhverve billeder og efterfølgende billeder analyseret ved hjælp af billedanalysesoftware. C) Der vises repræsentative DIC-billeder af MDA-MB-231-celler (taget en gang om dagen i fem dage). Envejs ANOVA efterfulgt af Dunnetts multiple sammenligningstest: *, P < 0,05. Skalastang, 100 μm.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
35-mm glass-bottomed Confocal No.1 culture dishes	MatTek Corporation	P35G-1.0-14-C	Precooled before use
Bovine serum albumin (BSA)	BioShop	ALB003.100	Used at 3% for IF
1.5 ml tubes	VWR	CA10011-700	CA10011-700
100-mm culture dish BD353003	VWR	CABD353003	Sterile, disposable
15 ml Falcon tube	VWR	CA21008-918	Sterile, disposable
1 ml filtered tips	VWR	10011-350	Sterile, disposable
200 μl filtered tips	VWR	22234-016	Sterile, disposable
20 μl filtered tips	VWR	22234-008	Sterile, disposable
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	F1051	Used at 10% (v/v)
RPMI 1640 Medium with Glutamine	Life Technologies	11875-119	Used for culturing of MDA-MB-231 cells
MEGM (bullet kit): MEBM (CC3151)+Single quots (CC4136)	Lonza	CC-3150	Used for culturing of MCF10A cells
Olympus IX-81 microscope	Olympus		Used for 3D culture imaging (DIC images at 10X and 40X)