3D Kultur Basement Membrane Assay: Culturing kræftceller på 3D Kælder Membran Protein Matrix at studere Cell Invasion

Hæld først kold kældermembranmatrix i en glasbundsskål og spred den jævnt med en pipettespids. Lad membranen størkne ved 37 grader Celsius, med en kontinuerlig forsyning af kuldioxid. Trypsiniser de fluorescerende mærkede kræftceller for at løsne dem fra pladens overflade og genbruge dem i et kulturmedium.

Overfør disse genanvendelige celler til et konisk rør og spin. Fjern supernatanten og genbrug cellerne i kulturmediet. Efter optælling blandes denne celleophæng, der indeholder det ønskede antal celler med kældermatrixen i et lige forhold.

Plade forsigtigt cellematrixblandingen på den størknede kældermembranmat-belagte skål. Lad cellematrixblandingen størkne ved 37 grader Celsius, med en kontinuerlig forsyning af kuldioxid. Når blandingen størkner, tilsæt kulturmedium til skålen og inkuber den i den ønskede periode.

Kræftceller kan danne actin-rige membran fremspring, og frigive proteaser at nedbryde den ekstracellulære matrix, og dermed invadere matrix. Placer skålen under et fluorescerende mikroskop med forskellige tidsintervaller for at analysere de celler, der danner fremspring. I eksemplet protokol, vil vi kultur brystkræftceller på en 3D kælder membran matrix til at studere invasionsprocessen.

Før du begynder kulturproceduren, skal du placere kælderens membranmatrix, en P200-pipette og pipettespidser på is natten over ved 4 grader Celsius. Den næste dag skal du bruge spidsen af den iskolde 200-mikroliter pipette til at sprede 50 mikroliter af matrixen i et spiralmønster over bunden af en Confocal nummer 1 glasbunds skål. Placer derefter skålen i en cellekulturinkubator ved 37 grader Celsius, med 5% kuldioxid, i mindst 30 minutter.

Mens matrixen er under størkning, trypsinize en 70% til 80% sammenflydende 100-millimeter plade af celler. Når cellerne er begyndt at løsne, inaktivere trypsin med 10 milliliter medium og derefter overføre celle suspension i en 15-milliliter konisk rør.

Centrifuge cellerne i tre minutter ved 100 Gs og 4 grader Celsius. Mens cellerne er spinning ned, aliquot 50 mikroliter matrix i en 1 milliliter mikrocentrifuge rør pr parabol af kælderen membran matrix og placere rørene på is. Når cellerne er færdige med at spinde, aspirere supernatanten uden at forstyrre pelleten og derefter genbruge cellerne i 1 milliliter medier og tælle dem.

Dernæst overføres 2,5 gange 10 til 4. celler til et nyt mikrocentrifugerør, der topper celleaffjedringen med medier til et endeligt volumen på 50 mikroliter. Tilsæt derefter de 50 mikroliter af iskold kældermembranmatrix til cellerne ved et 1:1-forhold for et endeligt volumen på 100 mikroliter. Plade forsigtigt matrixen til celleblandingen på den størknede kældermembranmatrix og lad cellerne blive indlejret i matrixen i cellekulturinkubatoren.

Efter 30 minutter skal du dække matrixen med 2 milliliter medier og placere skålen tilbage i inkubatoren og ændre mediet hver dag under eksperimentet. Brug 10x målet om et lysmikroskop en gang om dagen i eksperimentets varighed til at tage 20 differentialinterferenskontrastkontrastbilleder af kolonien suspenderet i kælderens membranmatrix. Analyser billederne blindt for at bestemme cellekoloniens stjernedannelse. En koloni anses for at være stjerne, hvis en eller flere fremskrivninger fra cellernes sfæroid observeres.