Summary
Drosophila melanogaster larven zorgen voor een ideaal modelsysteem om de mechanismen van het axonaal transport te onderzoeken binnen de larvale segmentale zenuwen. Met behulp van deze procedure, kan 3 e instar larven dragen verschillende mutaties worden vergeleken met wild-type larven.
Abstract
Drosophila melanogaster is in opkomst als een krachtige modelsysteem voor het bestuderen van de ontwikkeling en functie van het zenuwstelsel, met name vanwege de gunstige genetica en volledig gesequenced genoom. Bovendien, het larvale zenuwstelsel is een ideaal modelsysteem om de mechanismen van axonaal transport studie als het larvale segmentale zenuwen bevatten bundels van axonen met hun cellichamen gelegen in de hersenen en hun zenuwuiteinden eindigen langs de lengte van het lichaam. Hier beschrijven we de procedure voor de visualisatie van synaptische vesicles eiwitten in larvale segmentale zenuwen. Indien correct gedaan, alle componenten van het zenuwstelsel, samen met de omliggende weefsels, zoals spieren en NMJs, blijven intact, onbeschadigd, en klaar om te worden gevisualiseerd. 3 e instar larven voeren verschillende mutaties worden ontleed, vaste, geïncubeerd met synaptische blaasje antilichamen, gevisualiseerd en vergeleken met wild type larven. Deze procedure kan worden aangepast voor verschillende synaptic of neuronale antilichamen en veranderingen in de verdeling van een verscheidenheid van eiwitten kunnen gemakkelijk worden waargenomen binnen de larvale segmentale zenuwen.
Protocol
1. Voorbereiding van de reagentia
- Bereid 1x Dissection buffer met 128 mM NaCl, 4mm CaCl 2, 4mm MgCl 2, 2 mM KCl, 5mM HEPES en 36mm Sucrose. PH de oplossing voor 7.2 en filteren steriliseren.
- Bereid het fixatief met behulp van 01:01 verwatering van 16% formaldehyde en 1x Dissection Buffer.
- Bereid 1x PBT met 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bij een pH van 7,2 en Triton X-100 in een 1:100 verhouding.
- Bereid 5% Bovine Serum Albumine (BSA) met 0,01% Na Azide in 1x PBS.
2. Voorbereiding van de Dissection
- Sylgard gerechten worden gebruikt voor dissectie. Bereid de gerechten door het gieten van Sylgard 184 siliconenelastomeer basis en verharder mengsel in een petrischaal. Laat het mengsel volledig stollen en drogen voor gebruik.
- Voor de dissectie, verzamelt een schone paar van # 5 pincet, een schoon paar rechte blad vannas schaar, en pennen.
3. Dissectie van de 3 e Instar Larven
- Verzamel zwervende 3 e instar larven van een bepaald genotype op een petrischaal.
- Was de larven in gedeïoniseerd water om zich te ontdoen van het voedsel.
- Plaats een larve op de Sylgard schotel, met de dorsale zijde naar boven. Speld de larve in zijn voorste en achterste uiteinden.
- Breng een druppel 1x Dissection Buffer op de gespeld larve. Met behulp van fijne schaar nip de larve op de dorsale middellijn de buurt van de achterste einde. Met behulp van de schaar, knip de larvale cuticula van de achterste uiteinde tot aan het voorste einde.
- Plaats een druppel van nieuwe 1x Dissection Buffer op de ontleed larve. Met behulp van een pin, kies een laterale rand van de cuticula in het midden van de larve en speld de cuticula. Met behulp van een andere pin, pin de tweede laterale rand van de cuticula zoals weergegeven in het diagram. Twee pinnen worden gebruikt op elke laterale zijde. Zie schema hieronder.
- Verwijder voorzichtig de darmen, vet lichamen en luchtpijp, waardoor alleen de hersenen met de twee optische lobben en ventrale ganglia met de aangehechte segmentale zenuwen. De rest van de procedure is gedaan op de Sylgard schotel.
4. Fixatie van de ontleed Larve
- Incubeer de ontleed larve in de oplossing voor 30 minuten, door vervanging van de fix elke 15 minuten.
- Na fixatie, spoel de larve in 1x PBT gedurende 30 minuten door het vervangen van de buffer elke 10 minuten. Het is belangrijk op te merken dat de larve altijd moet worden in een buffer.
5. Antilichaam kleuring van het ontleed Larve
- Bereid de primaire antilichaam door het verdunnen van het aan de juiste concentratie in 5% BSA met Na Azide in 1x PBT. Optimale concentratie verschilt voor verschillende antilichamen.
- Vervang de laatste 1x PBT spoelen met de voorbereide primaire antilichaam oplossing en incubeer in een vochtige kamer bij 4 ° C gedurende de nacht. De vochtige kamer wordt geconstrueerd door voering een plastic schaaltje met kim-doekjes gedrenkt in water.
- De volgende dag, spoel de ontleed larve in 1x PBT gedurende 30 minuten door het vervangen van de buffer elke 10 minuten.
- Bereid het secundaire antilichaam door het verdunnen van het aan de juiste concentratie in 5% BSA met Na Azide in 1x PBT en incubeer de larve met het secundaire antilichaam oplossing bij 25 ° C gedurende een uur. Wikkel de vochtige kamer in folie aan het licht te voorkomen, als secundaire antilichamen zijn lichtgevoelig.
- Na incubatie, spoel de larve in 1x PBT gedurende 30 minuten door het vervangen van de buffer elke 10 minuten.
6. Montage en Visualisatie van de ontleed Larve
- Voor de montage van de larve op de dia, de voorbereiding van de glijbaan door het verspreiden van twee verticale lijnen van de nagellak in het midden, met een ruimte genoeg voor een dekglas om op te zitten (zie diagram). Laat de nagellak drogen.
- Plaats een druppel montage buffer in de ruimte tussen de verticale nagellak lijnen op het slide (zie diagram). De dia is nu klaar voor montage.
- Na de laatste 1x PBT spoelen, verwijder voorzichtig de laterale pinnen. Wees voorzichtig om niet scheurt de cuticula.
- Verwijder voorzichtig de twee overgebleven pinnen en pak de larve met een tang en horizontaal plaatsen van de larve op de voorbereide dia. Zorg ervoor dat de larve is niet omgedraaid en is gericht op ventrale zijde naar boven.
- Plaats voorzichtig een dekglas op de top en sluit de randen met nagellak (zie diagram). De larve is nu klaar voor visualisatie onder een fluorescentiemicroscoop.
7. Representatieve resultaten
Figuur 1: Een representatief beeld van de larvale segmentale zenuwen van een wild-type LARVeen met behulp van antilichamen tegen het synaptische vesikel eiwit cysteïne snaar proteïne (CSP, Zinsmaier et al.. 1994). Merk op dat de segmentale zenuwen zijn soepel gekleurd. Bar = 20μm
Figuur 2: Een representatief beeld van de larvale segmentale zenuwen van een motor eiwit mutant larve met behulp van antilichamen tegen het synaptische vesikel eiwit cysteïne snaar proteïne (CSP). Merk op dat de segmentale zenuwen enorme accumulatie die helder vlek voor CSP (pijlen) te tonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De Drosophila larvale segmentale zenuwen zijn een krachtig systeem om mechanismen in axonaal transport te bestuderen. Als de 3 e instar larven dissectie correct wordt uitgevoerd, kan alle componenten van het CZS, PNS, en de bijbehorende weefsel, zoals de spieren en NMJs, worden onderzocht binnen een enkele larve. We hebben aangepast dit protocol bij het ene gepubliceerd door Hurd en Saxton (1996). Dit protocol kan ook worden aangepast aan andere neuronale antistoffen te testen, maar optimalisatie van antilichamen moet worden gedaan. De primaire en secundaire antilichaam incubatie tijden kunnen worden gewijzigd of een blokkering stap kan worden toegevoegd. We hebben met succes gebruik gemaakt van deze protocol om de rol van het amyloïd precursor proteïne 1 en 2 in huntingtine axonaal transport te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
SG wordt ondersteund door middelen van de State University van New York in Buffalo en van John R. Oishei Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Minutien Pins, Stainless Steel | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Mcpherson-Vannas Straight Blade 8cm Scissors | Fisher Scientific | 50822236 | |
| Vectashield, Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Sylgard 184 Silicone elastomer | Dow Corning | 4026148 | |
| formaldehyde, 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| dCSP3 | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11004 |
References
- Gunawardena, S., Goldstein, L. Disruption of Axonal Transport and Neuronal Viability by Amyoid Precursor Protein Mutations in Drosophila. Neuron. 32 (2), 389-401 (2001).
- Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40 (1), 1-2 (2003).
- Hurd, D. D., Saxton, W. M. Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila. Genetics. 144 (3), 1075-1085 (1996).
- Zinsmaier, K. E., Eberle, K. K., Buchner, E., Walter, N., Benzer, S. Paralysis and early death in cysteine string protein mutants of Drosophila. Science. 263, 977-980 (1994).
