Summary
Drosophila melanogaster larvas de disponer de un sistema modelo ideal para investigar los mecanismos de transporte axonal en larvas de los nervios segmentarios. El uso de este procedimiento, 3 de larvas portadoras de mutaciones diferentes pueden ser comparados a las larvas de tipo salvaje.
Abstract
Drosophila melanogaster se está convirtiendo en un modelo de sistema de gran alcance para el estudio del desarrollo y la función del sistema nervioso, sobre todo por su genética y conveniente genoma secuenciado en su totalidad. Además, el sistema nervioso de larvas es un sistema modelo ideal para estudiar los mecanismos de transporte axonal de los nervios segmentarios larvas contienen haces de axones con sus cuerpos celulares situados en el cerebro y sus terminales de las terminaciones nerviosas a lo largo de la longitud del cuerpo. A continuación se describe el procedimiento para la visualización de proteínas de vesículas sinápticas en las larvas nervios segmentarios. Si se hace correctamente, todos los componentes del sistema nervioso, junto con los tejidos correspondientes, tales como los músculos y NMJs, permanecen intactos y en buen estado y listo para ser visualizado. 3 º estadio las larvas portadoras de mutaciones diferentes se disecan, fijo, se incubaron con anticuerpos vesículas sinápticas, visualizar y en comparación con las larvas de tipo salvaje. Este procedimiento se puede adaptar a varios anticuerpos diferentes sináptica o neuronal y los cambios en la distribución de una variedad de proteínas pueden ser fácilmente observado en larvas de los nervios segmentarios.
Protocol
1. Preparación de los reactivos
- Prepare 1x Buffer disección de 128 mM NaCl, 4 mM CaCl 2, 4 mM MgCl 2, 2 mM KCl, HEPES 5 mM y sacarosa 36 mm. PH de la solución al 7,2 y el filtro de esterilización.
- Preparar el fijador con una dilución 1:01 del 16% de formaldehído y el tampón de disección 1x.
- Prepare 1x 1x PBT con tampón fosfato salino (PBS) a un pH de 7.2 y Triton X-100 en una proporción de 1:100.
- Prepare un 5% albúmina de suero bovino (BSA) con 0,01% de azida Na en 1x PBS.
2. Preparación para la disección
- Sylgard platos se utilizan para la disección. Prepare los platos a base de verter Sylgard 184 elastómero de silicona y curado mezcla de agente en una placa de Petri. Dejar que la mezcla se solidifique por completo y seco antes de usar.
- Antes de la disección, se reúnen un par limpio de # 5 pinzas, un par limpio de hoja recta Vannas tijeras y alfileres.
3. La disección de 3 º estadio las larvas
- Recoger vagando 3 º estadio las larvas de un genotipo específico en una placa de Petri.
- Lavado de las larvas en agua desionizada para deshacerse de la comida.
- Colocar una larva en el plato Sylgard, con el lado dorsal. Pin de la larva en sus extremos anterior y posterior.
- Coloque una gota de tampón 1x disección de las larvas puestas. Usando tijeras finas cortar la larva en la línea media dorsal cerca del extremo posterior. Con las tijeras, corte la cutícula larval desde el extremo posterior hasta el final anterior.
- Coloque una gota de tampón 1x nueva disección en la larva disecada. El uso de un PIN, elige uno de los bordes laterales de la cutícula, cerca de la mitad de la larva y el pin de la cutícula. El uso de otro pin, pin el segundo borde lateral de la cutícula como se muestra en el diagrama. Dos pines se utilizan en cada lado lateral. Vea el diagrama a continuación.
- Retire con cuidado los intestinos, los órganos de la grasa, y la tráquea, dejando sólo el cerebro con los dos lóbulos ópticos y los ganglios ventrales de los nervios segmentarios adjunto. El resto del procedimiento se hace en el plato Sylgard.
4. La fijación de la larva disecados
- Incubar la larva disecados en solución durante 30 minutos, mediante la sustitución de la solución cada 15 minutos.
- Después de la fijación, enjuague la larva en 1x PBT durante 30 minutos, sustituyendo el tampón cada 10 minutos. Es importante señalar que la larva debe estar siempre en un búfer.
5. La tinción de anticuerpos de la larva disecados
- Prepare el anticuerpo primario mediante la dilución a la concentración adecuada en el 5% BSA con Na azida en 1x PBT. Las concentraciones óptimas serán diferentes para diferentes anticuerpos.
- Vuelva a colocar la última PBT 1x enjuague con la solución de anticuerpo primario preparado, y se incuba en una cámara húmeda a 4 ° C durante la noche. La cámara húmeda se construye por el forro un plato de plástico con kim-paños empapados en agua.
- Al día siguiente, enjuagar la larva disecado en 1x PBT durante 30 minutos, sustituyendo el tampón cada 10 minutos.
- Prepare la secundaria de anticuerpos mediante la dilución a la concentración adecuada en el 5% BSA con Na azida en 1x PBT, e incubar la larva con la solución de anticuerpo secundario a 25 ° C durante una hora. Envuelva la cámara húmeda en papel de aluminio para evitar que la luz, como anticuerpos secundarios son sensibles a la luz.
- Después de la incubación, lavar la larva en 1x PBT durante 30 minutos, sustituyendo el tampón cada 10 minutos.
6. De montaje y visualización de la larva disecados
- Antes de montar la larva de la diapositiva, preparar la diapositiva mediante la difusión de dos líneas verticales de esmalte de uñas en el medio, con un espacio suficiente para una hoja de cubierta para sentarse (ver diagrama). Deja que el esmalte de uñas se seque por completo.
- Coloque una gota de tampón de montaje en el espacio entre las líneas verticales pulir las uñas en la diapositiva (ver diagrama). La diapositiva está listo para el montaje.
- Después del último enjuague PBT 1x, retire con cuidado las clavijas laterales. Tenga cuidado de no romper la cutícula.
- Retire con cuidado las dos patillas restantes y recoger las larvas con pinzas y colocar la larva en posición horizontal sobre la diapositiva preparada. Asegúrese de que la larva no se dio la vuelta y es la parte ventral orientada hacia arriba.
- Con cuidado, coloque una hoja de cubierta en la parte superior y selle los bordes con esmalte de uñas (ver diagrama). La larva ya está listo para la visualización en un microscopio de fluorescencia.
7. Resultados representante
Figura 1: Una imagen representativa de las larvas de los nervios segmentarios de un tipo salvaje LARVun uso de anticuerpos contra la proteína de vesículas sinápticas proteínas cadena cisteína (CSP, Zinsmaier et al. 1994). Tenga en cuenta que los nervios segmentarios están suavemente manchado. Bar = 20μm
Figura 2: Una imagen representativa de las larvas de los nervios segmentarios de una larva de la proteína mutante motor usando anticuerpos contra la proteína de la vesícula sináptica proteína cadena cisteína (CSP). Tenga en cuenta que los nervios segmentarios muestran acumulaciones masivas que se tiñen intensamente para CSP (flechas).
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Discussion
Los nervios larvas de Drosophila segmentaria es un poderoso sistema para estudiar los mecanismos en el transporte axonal. Si el 3 º estadio larval disección se realiza correctamente, todos los componentes del sistema nervioso central, sistema nervioso periférico, y los tejidos asociados, como los músculos y NMJs, puede ser examinado dentro de una sola larva. Hemos adaptado el protocolo a partir de la publicada por Hurd y Saxton (1996). Este protocolo también se puede adaptar a otra prueba de anticuerpos neuronales, pero la optimización de los anticuerpos se debe hacer. Los tiempos de anticuerpos primaria y secundaria de incubación puede ser cambiado o el bloqueo de un paso se puede añadir. Hemos utilizado con éxito este protocolo para investigar el papel de la proteína precursora de amiloide 1 y 2 huntingtina en el transporte axonal.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
SG es apoyado por fondos de la Universidad Estatal de Nueva York en Buffalo y de John R. Oishei Fundación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Minutien Pins, Stainless Steel | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Mcpherson-Vannas Straight Blade 8cm Scissors | Fisher Scientific | 50822236 | |
| Vectashield, Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Sylgard 184 Silicone elastomer | Dow Corning | 4026148 | |
| formaldehyde, 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| dCSP3 | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11004 |
References
- Gunawardena, S., Goldstein, L. Disruption of Axonal Transport and Neuronal Viability by Amyoid Precursor Protein Mutations in Drosophila. Neuron. 32 (2), 389-401 (2001).
- Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40 (1), 1-2 (2003).
- Hurd, D. D., Saxton, W. M. Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila. Genetics. 144 (3), 1075-1085 (1996).
- Zinsmaier, K. E., Eberle, K. K., Buchner, E., Walter, N., Benzer, S. Paralysis and early death in cysteine string protein mutants of Drosophila. Science. 263, 977-980 (1994).
