Summary
Drosophila melanogaster larves fournir un système modèle idéal pour étudier les mécanismes du transport axonal dans les larves de nerfs segmentaires. En utilisant cette procédure, 3 e stade larvaire porteuses de mutations différentes peuvent être comparés à des larves de type sauvage.
Abstract
Drosophila melanogaster apparaît comme un système modèle puissant pour étudier le développement et la fonction du système nerveux, notamment en raison de sa génétique commode et génome entièrement séquencé. De plus, le système nerveux des larves est un système modèle idéal pour étudier les mécanismes du transport axonal que les nerfs des larves segmentaire contiennent faisceaux d'axones avec leurs corps cellulaires situés dans le cerveau et leurs terminaisons nerveuses finissant le long du corps. Nous décrivons ici la procédure pour la visualisation des protéines des vésicules synaptiques dans les larves de nerfs segmentaires. Si fait correctement, tous les composants du système nerveux, avec des tissus associés tels que les muscles et NMJs, restent intacts, intact et prêt à être visualisé. 3 e stade larvaire porteuses de mutations différentes sont disséqués, fixe, incubées avec des anticorps vésicules synaptiques, visualisées et comparées à des larves de type sauvage. Cette procédure peut être adaptée pour plusieurs anticorps différents synaptique ou neuronales et des changements dans la distribution d'une variété de protéines peuvent être facilement observées au sein des larves nerfs segmentaires.
Protocol
1. Préparation des réactifs
- Préparer 1x tampon Dissection utilisant 128 mM de NaCl, 4mm CaCl 2, 4mm MgCl2, 2 mM de KCl, HEPES 5mm et 36mm saccharose. PH de la solution à 7,2 et stériliser par filtration.
- Préparer le fixateur en utilisant une dilution 1:01 de formaldéhyde 16% et le tampon de dissection 1x.
- Préparer 1x PBT aide 1x tampon phosphate salin (PBS) à un pH de 7,2 et de Triton X-100 dans un rapport 1:100.
- Préparer 5% albumine sérique bovine (BSA) avec 0,01% de Na azide dans du PBS 1X.
2. Préparation de la dissection
- Sylgard plats sont utilisés pour la dissection. Préparer les plats en versant Sylgard 184 de base d'élastomère de silicone et de durcissement mélange d'agents dans une boîte de Pétri. Laisser le mélange complètement solidifier et sécher avant de l'utiliser.
- Avant la dissection, de recueillir une paire propre du n ° 5 pinces, une paire de ciseaux propres des droites Vannas lame, et des épingles.
3. La dissection de 3 e stade larvaire
- Recueillir errance 3 e stade larvaire d'un génotype spécifique sur une boîte de Pétri.
- Laver les larves dans l'eau déminéralisée pour se débarrasser de la nourriture.
- Placez une larve sur le plat Sylgard, avec la place face dorsale. Pin de la larve à ses extrémités antérieures et postérieures.
- Déposer une goutte de tampon de dissection 1x sur la larve épinglés. Utiliser des ciseaux bien étouffer la larve sur la ligne médiane dorsale près de l'extrémité postérieure. L'aide des ciseaux, couper la cuticule des larves de l'extrémité postérieure jusqu'à l'extrémité antérieure.
- Déposer une goutte de tampon de dissection nouvelle 1x sur la larve disséquée. En utilisant une épingle, prendre un bord latéral de la cuticule peu près au milieu de la larve et la broche de la cuticule. En utilisant une autre broche, la broche le second bord latéral de la cuticule comme le montre le diagramme. Deux broches sont utilisés sur chaque côté latéral. Voir schéma ci-dessous.
- Retirez délicatement les intestins, des corps gras, et de la trachée, ne laissant que le cerveau avec les deux lobes optiques et les ganglions ventraux avec les nerfs segmentaires ci-joint. Le reste de la procédure se fait sur le plat Sylgard.
4. Fixation de la Larve Disséqué
- Incuber la larve disséquée dans le correctif pour 30 minutes, en remplaçant le correctif toutes les 15 minutes.
- Après fixation, rincer la larve dans 1x PBT pendant 30 minutes en remplaçant le tampon toutes les 10 minutes. Il est important de noter que la larve doit toujours être dans un tampon.
5. Coloration des anticorps de l'Larve Disséqué
- Préparer l'anticorps primaire en le diluant à la concentration appropriée dans BSA 5% avec Na azide dans 1x PBT. Concentrations optimales diffèrent des anticorps différents.
- Remplacer le dernier 1x PBT rincer avec la solution d'anticorps primaires préparées, et incuber dans une chambre humide à 4 ° C pendant la nuit. La chambre humide est construit en alignant un plat de plastique avec kim-lingettes imbibées dans l'eau.
- Le lendemain, rincez-la larve disséquée en 1x PBT pendant 30 minutes en remplaçant le tampon toutes les 10 minutes.
- Préparer l'anticorps secondaire en le diluant à la concentration appropriée dans BSA 5% avec Na azide dans 1x PBT, et incuber la larve avec la solution d'anticorps secondaire à 25 ° C pendant une heure. Enveloppez la chambre humide dans du papier pour empêcher la lumière, comme des anticorps secondaires sont sensibles à la lumière.
- Après incubation, laver la larve dans 1x PBT pendant 30 minutes en remplaçant le tampon toutes les 10 minutes.
6. Montage et visualisation de la larve Disséqué
- Avant de monter la larve sur la lame, de préparer la diapositive en diffusant deux lignes verticales de vernis à ongles dans le milieu, avec un espace suffisant pour une lamelle de s'asseoir sur (voir schéma). Laissez les ongles sécher complètement.
- Déposer une goutte de tampon de fixation dans l'espace entre les lignes verticales des ongles vernis sur la diapositive (voir schéma). La lame est maintenant prête pour le montage.
- Après le dernier 1x PBT rincer, retirer délicatement les broches latérales. Attention à ne pas déchirer la cuticule.
- Retirez délicatement les deux broches restantes et ramasser la larve avec une pince et le lieu de la larve à l'horizontale sur la lame préparée. Assurez-vous que la larve n'est pas retourné et est orientée face ventrale en place.
- Placer délicatement une lamelle sur le dessus et sceller les bords avec du vernis à ongles (voir schéma). La larve est maintenant prête pour une visualisation sous un microscope à fluorescence.
7. Les résultats représentatifs
Figure 1: Une image représentant des larves de nerfs segmentaires à partir d'un type sauvage LARVune aide d'anticorps contre la protéine des vésicules synaptiques protéines chaîne de cystéine (CSP, Zinsmaier et al. 1994). Notez que les nerfs segmentaires sont harmonieusement colorées. Barre = 20μm
Figure 2: une image représentative des larves de nerfs segmentaires à partir d'une larve du moteur protéine mutante utilisant des anticorps contre la protéine des vésicules synaptiques protéines chaîne de cystéine (CSP). Notez que les nerfs segmentaires montrent des accumulations massives qui se colorent brillamment pour les CSP (flèches).
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Discussion
Les nerfs des larves de drosophile sont segmentaires un système puissant pour étudier les mécanismes de transport axonal. Si la 3 e stade larvaire dissection est effectuée correctement, toutes les composantes de la CNS, PNS, et des tissus associés, tels que les muscles et les NMJs, peuvent être examinées dans une seule larve. Nous avons adapté ce protocole de celui publié par Hurd et Saxton (1996). Ce protocole peut également être adapté pour tester d'autres anticorps neuronale, mais l'optimisation des anticorps devrait être fait. Les temps d'incubation primaire et secondaire d'anticorps peut être modifié ou une étape de blocage peuvent être ajoutés. Nous avons utilisé avec succès ce protocole pour enquêter sur le rôle de la protéine précurseur amyloïde 1 et 2 huntingtine dans le transport axonal.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
SG est soutenu par des fonds de l'Université d'État de New York à Buffalo et de la Fondation John R. Oishei.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Minutien Pins, Stainless Steel | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Mcpherson-Vannas Straight Blade 8cm Scissors | Fisher Scientific | 50822236 | |
| Vectashield, Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Sylgard 184 Silicone elastomer | Dow Corning | 4026148 | |
| formaldehyde, 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| dCSP3 | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11004 |
References
- Gunawardena, S., Goldstein, L. Disruption of Axonal Transport and Neuronal Viability by Amyoid Precursor Protein Mutations in Drosophila. Neuron. 32 (2), 389-401 (2001).
- Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40 (1), 1-2 (2003).
- Hurd, D. D., Saxton, W. M. Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila. Genetics. 144 (3), 1075-1085 (1996).
- Zinsmaier, K. E., Eberle, K. K., Buchner, E., Walter, N., Benzer, S. Paralysis and early death in cysteine string protein mutants of Drosophila. Science. 263, 977-980 (1994).
