Summary
Drosophila melanogaster larvaları larva segmental sinirler içinde aksonal taşıma mekanizmalarının araştırılması için ideal bir model sistem sağlar. Bu yordamı kullanarak, 3. instar larvaları çeşitli mutasyonları taşıyan vahşi tip larva mukayese edilebilir.
Abstract
Drosophila melanogaster, özellikle uygun genetik ve tam sıralı genom, sinir sisteminin gelişimi ve işlevi eğitim için güçlü bir model sistem olarak ortaya çıkmaktadır. Ayrıca, larva sinir sistemi, larva segmental sinirler, beyin ve sinir uçları vücut uzunluğu boyunca biten içinde bulunan hücre gövdeleri ile akson demetleri içerir aksonal taşıma mekanizmaları incelemek için ideal bir model sistem. Burada larva segmental sinirler içinde sinaptik vezikül proteinlerin görünüm için prosedürü açıklar. Eğer doğru yapılırsa, sinir sisteminin tüm bileşenleri, kas ve NMJs olarak ilişkili dokuları ile birlikte, sağlam, hasarsız ve görüntülenebilmekte hazır kalır. Çeşitli mutasyonları taşıyan 3. instar larvaları disseke, sabit, sinaptik vezikül antikorlar ile inkübe görüntülendi ve vahşi tip larvalara göre . Bu prosedür, larva segmental sinirler içinde kolayca görülebilir proteinlerin çeşitli dağıtım birkaç farklı sinaptik veya nöronal antikor ve değişiklikler için adapte edilebilir.
Protocol
1. Reaktiflerin hazırlanması
- 1x Diseksiyon Tampon 128 mM NaCl, 4mm CaCl 2, 4mm MgCl 2, 2 KCl mM, 5mM Hepes ve 36mm Sakkaroz kullanarak hazırlayın. PH 7.2 ve filtre çözüm sterilize edin.
- Fiksatif% 16 formaldehit ve 1x Diseksiyon Tampon 1:1 seyreltme kullanarak hazırlayın.
- 1x Fosfat kullanarak hazırlayın 1x PBT Saline (PBS) 1:100 oranında 7.2 ve Triton X-100 PH Tamponlu.
- Hazırla% 5 1x PBS içinde% 0.01 Azid Na Bovine Serum Albumin (BSA).
2. Diseksiyon için hazırlanması
- Sylgard yemekler diseksiyon için kullanılır. Sylgard 184 silikon elastomer tabanı dökme ve bir Petri kabı içine ajan karışım kür yemekleri hazırlayın. Karışımı kullanmadan önce tamamen katılaşmaya ve kurumaya bırakın.
- Diseksiyonu önce # 5 forseps temiz bir çift, düz bıçak vannas makas temiz bir çifti, ve pimler toplamak.
3. 3. Instar Larva diseksiyonu
- Üzerine belirli bir genotip 3. instar larvalar bir petri dolaşıp toplayın.
- Gıda kurtulmak için deiyonize su larvalar yıkayın.
- Dorsal yüzü yukarı ile bir larva, sylgard tabağına yerleştirin. Anterior ve posterior ucunda larva Pin.
- 1x Diseksiyon Tampon tutturulmuş larva bir damla yerleştirin. Ince makas nip dorsal orta hat posterior sonuna yakın larva kullanma. Makas kullanarak, ön ucu ile arka sonundan itibaren larva manikür kesti.
- Yeni 1x Diseksiyon Tampon bir damla disseke larva üzerine yerleştirin. Bir iğne kullanarak, manikür larva ortasına yakın bir lateral kenar almak ve manikür pin. Başka bir iğne ucu ile, ikinci şemada gösterildiği gibi kütikül lateral kenarı pin. Her yan tarafında iki iğne kullanılır. Aşağıdaki diyagrama bakınız.
- Dikkatlice bağlı segmental sinirler ile iki optik loblar ve ventral ganglionlar sadece beyin bırakarak, bağırsak, yağ organları, ve trakea çıkarın. Prosedürün geri kalan sylgard çanak yapılır.
4. Dissected Larva fiksasyonu
- Her 15 dakikada bir düzeltme yerine, 30 dakika boyunca düzeltme disseke larva inkübe edin.
- Fiksasyon sonra, 30 dakika boyunca her 10 dakikada bir tampon değiştirerek 1x PBT larva durulayın. Larva her zaman bir tampon gerektiğine dikkat etmek önemlidir.
5. Dissected Larva Antikor Boyama
- 1x PBT Na Azid% 5 BSA uygun konsantrasyona seyreltilmesi ile birincil antikor hazırlayın. Optimal konsantrasyonları farklı antikorları için farklı olacaktır.
- Son 1x PBT hazırlanan primer antikor çözümü ile temizleyin, durulayın ve nemli bir odasında 4 ° C gecede inkübe değiştirin. Nemli odasına kim-mendil ile suya batırılmış bir plastik tabak astarı tarafından yaptırılmıştır.
- Ertesi gün, 30 dakika boyunca her 10 dakikada bir tampon değiştirerek 1x PBT disseke larva durulayın.
- 1x PBT Na Azid% 5 BSA uygun konsantrasyona seyreltilmesi ile ikincil antikor hazırlayın ve bir saat boyunca 25 ° C'de ikincil antikor çözümü ile larva kuluçkaya yatmaktadır. Sekonder antikorlar ışığa karşı hassastır, ışık önlemek için nemli oda folyo ile sarın.
- Inkübasyondan sonra, her 10 dakikada bir tampon değiştirerek, 30 dakika boyunca 1x PBT larva yıkayın.
6. Dissected Larva Montaj ve Görselleştirme
- Slayt larva montajından önce, (bkz. diyagram) oturup bir kapak kayma için yeterli bir boşluk, orta oje iki dikey çizgiler yaymak slayt hazırlamak. Tamamen oje kuru olsun.
- Slayt üzerinde dikey oje hatları (bkz. diyagram) arasındaki boşluğu montaj tampon bir damla yerleştirin. Slayt montaj için hazır.
- Son 1x PBT durulama sonra lateral pimleri, yavaşça çıkarın. Manikür gözyaşı değil dikkatli olun.
- Kalan iki pinleri dikkatlice çıkarın ve forseps ile larva pick up ve larva hazırlanan slayt yatay yerde. Larva devrildiğinde ve odaklı ventral yüzü yukarı değildir emin olun.
- Üstüne bir kapak kayma yavaşça yerleştirin ve tırnak cilası ile kenarları mühür (bkz. diyagram). Larva şimdi bir floresan mikroskop altında görünüm için hazırdır.
7. Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 1: vahşi bir tür larv larva segmental sinirler bir temsili resimsinaptik vezikül protein sistein dize proteinine karşı antikor (CSP, Zinsmaier ve ark 1994). Segmental sinirler sorunsuz lekeli olduğunu unutmayın. Bar = 20μm
Şekil 2: sinaptik vezikül protein sistein dize protein (CSP) karşı antikorlar kullanarak bir motor protein mutant larva larva segmental sinirler bir temsilcisi görüntü. Segmental sinirler CSP (oklar) parlak leke büyük birikimleri unutmayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Drosophila larva segmental sinirler aksonal taşıma mekanizmaları incelemek için güçlü bir sistem. 3. instar larva diseksiyonu doğru yapılırsa, kas ve NMJs olarak MSS, PNS ve ilişkili doku, tüm bileşenleri tek bir larvanın içinde incelenebilir. Biz bu protokolü Hurd ve Saxton (1996) tarafından yayınlanan bir uyum var. Bu protokol aynı zamanda diğer nöronal antikor testi için adapte olabilir, ancak antikorlar optimizasyonu yapılmalıdır. Primer ve sekonder antikor inkübasyon sürelerinde değişiklik olabilir veya engelleyici bir adım eklenebilir. Biz başarıyla amiloid prekürsör protein 1 ve aksonal taşımacılığı Huntingtin 2 rolünü araştırmak için bu protokolü kullandık.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
SG, Buffalo New York Devlet Üniversitesi ve John R. Oishei Vakfı fonları tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Minutien Pins, Stainless Steel | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Mcpherson-Vannas Straight Blade 8cm Scissors | Fisher Scientific | 50822236 | |
| Vectashield, Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Sylgard 184 Silicone elastomer | Dow Corning | 4026148 | |
| formaldehyde, 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| dCSP3 | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11004 |
References
- Gunawardena, S., Goldstein, L. Disruption of Axonal Transport and Neuronal Viability by Amyoid Precursor Protein Mutations in Drosophila. Neuron. 32 (2), 389-401 (2001).
- Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40 (1), 1-2 (2003).
- Hurd, D. D., Saxton, W. M. Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila. Genetics. 144 (3), 1075-1085 (1996).
- Zinsmaier, K. E., Eberle, K. K., Buchner, E., Walter, N., Benzer, S. Paralysis and early death in cysteine string protein mutants of Drosophila. Science. 263, 977-980 (1994).
