Summary
Drosophila melanogaster larver ger en idealisk modell för att undersöka mekanismerna för axonal transport inom larver segmentell nerver. Med hjälp av detta förfarande kan 3: e INSTAR larver bär olika mutationer kan jämföras med vild typ larver.
Abstract
Drosophila melanogaster framstår som en kraftfull modell för att studera utveckling och funktion av nervsystemet, framför allt på grund av dess praktiska genetik och fullt sekvenseras genomet. Dessutom är larver nervsystemet ett idealiskt modellsystem för att studera mekanismer för axonal transport som larver segmentella nerver innehåller buntar av axoner med sin cell kroppar ligger i hjärnan och deras nervterminalerna slut längs kroppen. Här beskriver vi proceduren för visualisering av synaptiska vesikler proteiner inom larver segmentell nerver. Om det görs på rätt sätt, alla komponenter av nervsystemet, tillsammans med tillhörande vävnader som muskler och NMJs, förblir intakt, oskadad, och redo att visualiseras. 3: e INSTAR larver bär olika mutationer är dissekeras, fasta, inkuberas med synaptiska vesikler antikroppar, visualiseras och jämfört med vild typ larver. Detta förfarande kan anpassas för flera olika synaptic eller neuronala antikroppar och förändringar i fördelningen av en mängd olika proteiner kan lätt observeras inom larver segmentell nerver.
Protocol
1. Beredning av reagenser
- Förbered 1x Dissection buffert med 128 mM NaCl, 4mm CaCl 2, 4mm MgCl 2, 2 mm KCl, 5mm HEPES och 36 mm sackaros. PH lösningen på 7,2 och filtrera sterilisera.
- Förbered fixativ hjälp 01:01 utspädning om 16% formaldehyd och 1x Dissection buffert.
- Förbered 1x PBT med 1x Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid pH 7,2 och Triton X-100 i en 1:100 förhållande.
- Bered 5% bovint serumalbumin (BSA) med 0,01% Na Azid i 1x PBS.
2. Förberedelse för Dissection
- Sylgard rätter används för dissekering. Förbered rätter genom att hälla Sylgard 184 bas silikon elastomer och härdare blandningen i en petriskål. Låt blandningen helt stelna och torka före användning.
- Före dissektion, samla en ren par # 5 pincett, en ren par rakt blad Vannas sax och stift.
3. Dissekering av 3: e Instar Larver
- Samla vandrande 3: e INSTAR larver av en specifik genotyp på en petriskål.
- Tvätta larver i avjoniserat vatten för att bli av med maten.
- Placera en larv på sylgard skålen med ryggsidan uppåt. Nåla fast larven på dess främre och bakre ändar.
- Placera en droppe 1x Dissection buffert på nålas larv. Använda fina sax kväva larven på dorsala mittlinjen nära den bakre änden. Med hjälp av saxar, skär larver nagelbanden från den bakre änden fram till den främre änden.
- Placera en droppe av nya 1x Dissection buffert på dissekeras larv. Med hjälp av en PIN-kod, välj en sidokant av nagelband nära mitten av larven och stift nagelbanden. Använda ett annat stift, stift den andra laterala kanten av nagelband som visas i diagrammet. Två stift används på varje laterala sida. Se diagram nedan.
- Ta försiktigt bort tarmen, fett kroppar och luftstrupe, vilket innebär att endast hjärnan med två optiska loberna och ventrala ganglier med bifogade segmentell nerverna. Resten av förfarandet sker på sylgard skålen.
4. Fixering av dissekerade Larva
- Inkubera dissekerade larven i fix för 30 minuter, genom att ersätta fixa var 15 minut.
- Efter fixering, skölj larven i 1x PBT i 30 minuter genom att ersätta den buffert var 10 minut. Det är viktigt att notera att larven alltid ska vara i en buffert.
5. Antikropp färgning av dissekerade Larva
- Förbered den primära antikroppen genom att späda det till lämplig koncentration på 5% BSA med Na Azid i 1x PBT. Optimal koncentration skiljer sig mellan olika antikroppar.
- Ersätt sista 1x PBT skölj med den förberedda primära antikroppen lösning och inkubera i en fuktig kammare vid 4 ° C över natten. Den fuktkammare är konstruerad genom att rada en plast skål med Kim-våtservetter indränkt i vatten.
- Följande dag, skölj dissekerade larven i 1x PBT i 30 minuter genom att ersätta den buffert var 10 minut.
- Förbered sekundär antikropp genom att späda det till lämplig koncentration på 5% BSA med Na Azid i 1x PBT och inkubera larven med den sekundära antikroppen lösning vid 25 ° C i en timme. Linda fuktkammare i folie för att förhindra att ljus, som sekundära antikroppar är ljuskänsliga.
- Efter inkubation, skölj larven i 1x PBT i 30 minuter genom att ersätta den buffert var 10 minut.
6. Montering och visualisering av dissekerade Larva
- Före montering larven på bilden, förbereda bilden genom att sprida två vertikala linjer av nagellack i mitten, med ett utrymme nog för ett täckglas att sitta på (se diagram). Låt nagellacket torka helt.
- Placera en droppe montering buffert i utrymmet mellan de vertikala nagellack linjer på bilden (se diagram). Bilden är nu klar för montering.
- Efter sista 1x PBT skölj försiktigt bort den laterala stift. Var noga med att inte riva på nagelbanden.
- Ta försiktigt bort de två kvarvarande stiften och plocka upp larven med pincett och placera larven horisontellt på den förberedda bilden. Se till att larven inte välte och riktar ventrala sidan upp.
- Placera försiktigt ett täckglas ovanpå och försegla kanterna med nagellack (se diagram). Larven är nu klar för visning under ett fluorescerande mikroskop.
7. Representativa resultat
Figur 1: En representant bild av larver segmentella nerver från en vild typ Larven med hjälp av antikroppar mot det synaptiska vesikelproteinet cystein sträng protein (CSP, Zinsmaier et al. 1994). Observera att segmentella nerver smidigt fläckig. Bar = 20 mikroM
Figur 2: En representant bild av larver segmentella nerver från en motor protein mutant larv med antikroppar mot de synaptiska vesikelproteinet cystein sträng protein (CSP). Observera att segmentella nerver visar enorma ansamlingar att färga ljust för CSP (pilar).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den Drosophila larver segmentella nerver är ett kraftfullt system för att studera mekanismer i axonal transport. Om den 3: e INSTAR larver dissektion utförs korrekt, kan alla delar av CNS, PNS och tillhörande vävnad, såsom muskler och NMJs, prövas i en enda larv. Vi har anpassat detta protokoll från en publicerad av Hurd och Saxton (1996). Detta protokoll kan också anpassas för att testa andra neuronala antikroppar, men optimering av antikroppar bör göras. Den primära och sekundära antikroppen inkubationstiderna kan ändras eller en blockerande steg kan läggas till. Vi har med framgång använt detta protokoll för att undersöka den roll som amyloid prekursor protein 1 och huntingtin 2 i axonal transport.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
SG stöds av medel från State University of New York at Buffalo och från John R. Oishei Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Minutien Pins, Stainless Steel | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Mcpherson-Vannas Straight Blade 8cm Scissors | Fisher Scientific | 50822236 | |
| Vectashield, Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Sylgard 184 Silicone elastomer | Dow Corning | 4026148 | |
| formaldehyde, 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| dCSP3 | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11004 |
References
- Gunawardena, S., Goldstein, L. Disruption of Axonal Transport and Neuronal Viability by Amyoid Precursor Protein Mutations in Drosophila. Neuron. 32 (2), 389-401 (2001).
- Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40 (1), 1-2 (2003).
- Hurd, D. D., Saxton, W. M. Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila. Genetics. 144 (3), 1075-1085 (1996).
- Zinsmaier, K. E., Eberle, K. K., Buchner, E., Walter, N., Benzer, S. Paralysis and early death in cysteine string protein mutants of Drosophila. Science. 263, 977-980 (1994).
