Summary
Drosophila melanogaster-Larven bieten ein ideales Modellsystem, um die Mechanismen der axonalen Transport innerhalb Larven segmentalen Nerven zu untersuchen. Mit diesem Verfahren können 3 rd Larvenstadium, die verschiedene Mutationen zu Wildtyp-Larven verglichen werden.
Abstract
Drosophila melanogaster ist ein leistungsfähiges Modell für die Untersuchung der Entwicklung und Funktion des Nervensystems, vor allem wegen seiner günstigen Genetik und vollständig sequenzierten Genoms entstehen. Darüber hinaus ist die Larve des Nervensystems ein ideales Modellsystem, um Mechanismen der axonalen Transport Studie als Larven segmentalen Nerven Bündel von Axonen mit ihrem Zellkörper im Gehirn und die Nerven-Terminals endet entlang der Länge des Körpers befindet enthalten. Hier beschreiben wir das Verfahren zur Visualisierung der synaptischen Vesikel Proteine innerhalb Larven segmentalen Nerven. Wenn es richtig gemacht, alle Komponenten des Nervensystems, zusammen mit der dazugehörigen Gewebe wie Muskeln und NMJs, bleiben intakt und unbeschädigt, und bereit, visualisiert werden. 3 rd Larvenstadium, die verschiedene Mutationen seziert werden, fest, inkubiert mit synaptischen Vesikel Antikörper, visualisiert und im Vergleich zum Wildtyp-Larven. Dieser Vorgang kann für mehrere verschiedene synaptischen oder neuronalen Antikörpern und Veränderungen in der Verteilung einer Vielzahl von Proteinen angepasst werden können innerhalb von Larven segmentalen Nerven beobachtet werden.
Protocol
1. Vorbereitung der Reagenzien
- Bereiten 1x Dissection Buffer mit 128 mM NaCl, 4mm CaCl 2, 4mm MgCl 2, 2 mM KCl, 5 mM HEPES und 36mm Sucrose. PH der Lösung auf 7,2 und Filter zu sterilisieren.
- Bereiten Sie das Fixiermittel mit 1:1-Verdünnung von 16% Formaldehyd und 1x Dissection Buffer.
- Bereiten 1x PBT mit 1x Phosphate Buffered Saline (PBS) bei einem pH von 7,2 und Triton X-100 in einer 1:100-Verhältnis.
- Bereiten Sie 5% Rinderserumalbumin (BSA) mit 0,01% Na in 1x PBS-Azid.
2. Vorbereitung für die Präparation
- Sylgard Gerichte sind für die Präparation verwendet. Bereiten Sie die Gerichte, die von Gießen Sylgard 184 Silicon-Elastomer-Basis und Härter-Gemisch in eine Petrischale. Lassen Sie die Mischung vollständig zu festigen und vor der Verwendung trocken.
- Vor der Dissektion, sammeln ein sauberes Paar Nr. 5 Pinzette, ein sauberes Paar gerader Klinge Vannas Schere und Stifte.
3. Dissection der 3. Larvenstadium
- Sammeln Sie wandern 3 rd Larvenstadium von einem bestimmten Genotyp auf eine Petrischale.
- Waschen Sie die Larven in deionisiertem Wasser, um loszuwerden, das Essen.
- Legen Sie eine Larve auf dem Sylgard Gericht, mit dem Rücken nach oben. Pin die Larve an seinem vorderen und hinteren Enden.
- Geben Sie einen Tropfen 1x Dissection Buffer auf die merken Larve. Mit einer feinen Schere nip die Larve auf der dorsalen Mittellinie in der Nähe des hinteren Endes. Mit der Schere, schneiden Sie die Larvencuticula vom hinteren Ende bis zum vorderen Ende.
- Geben Sie einen Tropfen neuer 1x Dissection Buffer auf den sezierten Larve. Mit einem Stift, wählen Sie einen seitlichen Rand der Kutikula der Nähe der Mitte der Larve und Pin die Nagelhaut. Mit anderen Pin, pin zweiten seitlichen Rand der Kutikula, wie in der Abbildung dargestellt. Zwei Stifte werden auf jeder seitlichen Seite verwendet. Siehe Abbildung unten.
- Entfernen Sie vorsichtig den Darm, Fettkörper, und der Luftröhre, so dass nur das Gehirn mit den beiden optischen Lappen und ventralen Ganglien mit der segmentalen Nerven angebracht. Der Rest des Verfahrens beruht auf der Sylgard Schüssel getan.
4. Die Fixierung der Dissected Larva
- Inkubieren seziert Larve in fix für 30 Minuten, indem das Update alle 15 Minuten.
- Nach der Fixierung, spülen Sie die Larve in 1x PBT für 30 Minuten mit dem Austausch der Puffer alle 10 Minuten. Es ist wichtig zu beachten, dass die Larve sollte immer in einem Puffer werden.
5. Antikörper-Färbung der Dissected Larva
- Bereiten Sie den primären Antikörper durch Verdünnen auf die geeignete Konzentration in 5% BSA mit Na-Azid in 1x PBT. Optimale Konzentrationen für verschiedene Antikörper unterscheiden.
- Ersetzen Sie die letzte 1x PBT mit dem vorbereiteten primärer Antikörper-Lösung spülen, und inkubieren in einer feuchten Kammer bei 4 ° C über Nacht. Die feuchte Kammer wird durch das Aufbringen einer Plastikschale mit kim-Tücher in Wasser eingeweicht gebaut.
- Am folgenden Tag, spülen Sie die seziert Larve in 1x PBT für 30 Minuten mit dem Austausch der Puffer alle 10 Minuten.
- Bereiten Sie den sekundären Antikörper durch Verdünnen auf die geeignete Konzentration in 5% BSA mit Na-Azid in 1x PBT und inkubieren die Larve mit dem sekundären Antikörper-Lösung bei 25 ° C für eine Stunde. Wickeln Sie den feuchten Kammer in Folie, um Licht zu verhindern, als Sekundärantikörper lichtempfindlich sind.
- Nach der Inkubation spülen die Larve in 1x PBT für 30 Minuten mit dem Austausch der Puffer alle 10 Minuten.
6. Montage und Visualisierung der Dissected Larva
- Vor der Montage der Larve auf dem Objektträger, bereiten Sie das Bild durch die Verbreitung zwei vertikale Linien von Nagellack in der Mitte, mit einem Raum genug für ein Deckglas zu sitzen (siehe Grafik). Lassen Sie den Nagellack trocknen.
- Geben Sie einen Tropfen der Montage-Puffer in den Raum zwischen den vertikalen Nagellack Linien auf der Folie (siehe Diagramm). Die Folie ist nun bereit zur Montage.
- Nach dem letzten 1x PBT spülen, entfernen Sie vorsichtig die seitlichen Zapfen. Achten Sie darauf, nicht reißen die Nagelhaut.
- Entfernen Sie vorsichtig die beiden verbleibenden Pins und holen die Larve mit einer Pinzette und Ort der Larve horizontal auf die vorbereitete Folie. Vergewissern Sie sich die Larve nicht umgedreht wird und orientiert sich Bauchseite auf.
- Gently Ort ein Deckglas auf und die Ränder mit Nagellack (siehe Diagramm). Die Larve ist nun bereit für die Visualisierung unter einem Fluoreszenzmikroskop.
7. Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 1: Ein repräsentatives Bild der Larven segmentalen Nerven von einem Wildtyp-Larveine using Antikörper gegen den synaptischen Vesikel Protein Cystein-String-Protein (CSP, Zinsmaier et al. 1994). Beachten Sie, dass die segmentalen Nerven reibungslos gefärbt sind. Bar = 20 um
Abbildung 2: Ein repräsentatives Bild der Larven segmentalen Nerven von einem Motor-Protein-Mutanten Larve mit Antikörpern gegen den synaptischen Vesikel Protein Cystein-String-Protein (CSP). Beachten Sie, dass die segmentalen Nerven massiven Ansammlungen, die hell für CSP (Pfeile) Flecken zeigen.
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Discussion
Die Drosophila Larve segmentalen Nerven sind ein leistungsfähiges System, Mechanismen in axonalen Transport zu studieren. Wenn die 3 rd instar Larven Dissektion korrekt durchgeführt wird, können alle Komponenten des ZNS, PNS, und die damit verbundenen Gewebe, wie die Muskeln und NMJs, innerhalb einer einzigen Larve untersucht werden. Wir haben dieses Protokoll von der von Hurd und Saxton (1996) veröffentlicht angepasst. Dieses Protokoll kann auch angepasst werden andere neuronale Antikörper-Test, sondern die Optimierung von Antikörpern getan werden sollte. Die primären und sekundären Antikörper Inkubationszeiten geändert werden kann oder eine Sperrung Schritt hinzugefügt werden können. Wir haben dieses Protokoll verwendet, um die Rolle des Amyloid-Precursor-Protein 1 und 2 in Huntingtin axonalen Transport zu untersuchen.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
SG wird durch Mittel aus der State University of New York at Buffalo und von John R. Oishei Foundation unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Minutien Pins, Stainless Steel | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Mcpherson-Vannas Straight Blade 8cm Scissors | Fisher Scientific | 50822236 | |
| Vectashield, Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Sylgard 184 Silicone elastomer | Dow Corning | 4026148 | |
| formaldehyde, 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| dCSP3 | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11004 |
References
- Gunawardena, S., Goldstein, L. Disruption of Axonal Transport and Neuronal Viability by Amyoid Precursor Protein Mutations in Drosophila. Neuron. 32 (2), 389-401 (2001).
- Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40 (1), 1-2 (2003).
- Hurd, D. D., Saxton, W. M. Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila. Genetics. 144 (3), 1075-1085 (1996).
- Zinsmaier, K. E., Eberle, K. K., Buchner, E., Walter, N., Benzer, S. Paralysis and early death in cysteine string protein mutants of Drosophila. Science. 263, 977-980 (1994).
