Summary
Drosophila melanogaster의 애벌레가 애벌레 segmental 신경 이내 axonal 수송의 메커니즘을 조사하기 위해 이상적인 모델 시스템을 제공합니다. 이 절차를 사용하여 다양한 변이를 갖고 제 3 instar의 애벌레는 야생 타입 애벌레 비교할 수 있습니다.
Abstract
Drosophila melanogaster 특히 때문에 편리 유전 완전 합성 게놈의 신경 계통의 발달과 기능을 연구를위한 강력한 모델 시스템으로 대두되고 있습니다. 또한, 애벌레 신경 시스템은 애벌레 segmental 신경이 신체의 길이를 따라 결말 두뇌 및 신경 터미널 내에있는 자신의 세포 기관과 axons의 번들을 포함하는 등 axonal 교통의 메커니즘을 연구하는 이상적인 모델 시스템입니다. 여기 애벌레 segmental 신경 사이 시냅스 소포 단백질의 시각화를위한 절차를 설명합니다. 제대로하면, 신경 시스템의 모든 구성 요소는 이러한 근육과 NMJs 등 관련 조직과 함께, 손상 손상 및 시각 준비가 남아있다. 다양한 변이를 갖고 제 3 instar의 애벌레가 해부되고, 고정 시냅스 소포 항체와 incubated, 시각 및 야생 입력 유충에 비해. 이 절차는 쉽게 애벌레 segmental 신경 내에서 볼 수 있습니다 단백질의 다양한 배포판에 여러 다른 시냅스의 연결 또는 항체 및 변경 적용할 수 있습니다.
Protocol
1. 시약의 준비
- 128 MM NaCl, CaCl 4mm짜리 2, 4mm짜리 MgCl 2, 2 KCl MM, 5mM HEPES 및 36mM 자당를 사용하여 절개 1X 버퍼를 준비합니다. PH 7.2 솔루션 및 필터 소독.
- 16 % 포름 알데히드 및 1X 해부 버퍼의 1시 1분 희석을 사용하여 정착액을 준비합니다.
- 1X 인산을 사용하여 1X PBT 준비 살린 (PBS)는 1:100 비율 7.2 그리고 Triton X - 100의 PH에 버퍼.
- 준비 5% 소 혈청 0.01 %가 1X PBS에서 Azide 나와 함께 (BSA) 알부민.
2. 해부를위한 준비
- Sylgard 요리는 절개에 사용됩니다. Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 기지를 따르고하고 페트리 접시에 에이전트 혼합물을 치료하여 요리를 준비합니다. 혼합물이 완전히 사용하기 전에 응고 및 건조 수 있습니다.
- 절개 전에 깨끗한 # 5 포셉의 쌍, 직선 블레이드 vannas 가위의 클린 쌍, 그리고 핀을를 수집합니다.
3. 제 3 Instar의 애벌레의 해부
- 배양 접시에 특정 유전자형 3 차 instar의 애벌레를 헤매고 수집합니다.
- 음식 없애 탈이온수에서 애벌레를 씻으십시오.
- 등의 측면까지 함께 sylgard 요리에 유충 놓으십시오. 그 앞쪽에 및 사후 끝에 유충을 핀.
- 고정된 유충에 1X 해부 버퍼의 드롭 놓습니다. 고급 가위 따다에게 사후 끝 근처 등의 정중선에 유충을 사용합니다. 가위를 사용하여 앞의 끝에 통해 사후 하순부터 애벌레 표피를 잘라.
- 해부 유충에 새로운 1X 해부 버퍼의 드롭 놓습니다. PIN을 사용하여 유충의 중간 근처 표피 중 하나 측면 가장자리를 선택하고 표피를 핀. 다른 핀 사용으로 그림과 같이 표피의 두 번째 측면 가장자리를 핀. 두 핀이 각 측면 측면에 사용됩니다. 아래 다이어그램을 참조하십시오.
- 조심스럽게 첨부 segmental 신경 함께 두 개의 광학 엽 (叶)과 복부 신경만을 두뇌를 떠나, 창자, 지방 단체 및 기관을 제거하십시오. 절차의 나머지 부분은 sylgard 요리에 이루어집니다.
4. 해부 유충의 고정
- 매 15 분 수정을 대체하여, 30 분 수정의 해부 유충 부화.
- 고정 후, 10 분 간격으로 버퍼를 교체하여 30 분 1X PBT의 유충을 씻어. 유충은 항상 버퍼에 있어야합니다하는 것이 중요합니다.
5. 해부 유충의 항체 스테 이닝
- 1X PBT에서 나 Azide와 5 % BSA의 적절한 농도를 diluting하여 기본 항체를 준비합니다. 최적의 농도는 다른 항체를 위해 다를 수 있습니다.
- 마지막 1X PBT은 준비된 차 항체 솔루션 린스, 4 ° C 하룻밤에 습기가 실내에 품어 바꿉니다. 습기 챔버가 물에 젖었 김 - 잎사귀와 플라스틱 접시를 안감으로 구성되어 있습니다.
- 그 다음날, 10 분 간격으로 버퍼를 교체하여 30 분 1X PBT에서 해부하는 유충을 씻어.
- 1X PBT에서 나 Azide와 5 % BSA의 적절한 농도를 diluting하여 이차 항체를 준비하고, 한 시간 동안 25 ° C에서 차 항체 솔루션 유충 부화. 이차 항체가 민감한 빛 있으므로, 빛을 방지하기 위해 호일에 습한 챔버를 바꿈.
- 부화 후 10 분 간격으로 버퍼를 교체하여 30 분 1X PBT의 유충을 씻어.
6. 장착 및 해부 유충의 시각화
- 슬라이드에있는 유충을 설치하기 전에 (그림 참조)에 앉을 수있는 커버 슬립을위한 충분한 공간, 중간에 매니큐어 두 수직선을 확산하여 슬라이드를 준비합니다. 완전히 손톱 폴란드 건조하자.
- 슬라이드에서 세로 매니큐어 라인 (그림 참조) 사이의 공간에 장착 버퍼의 한 방울을 넣으십시오. 슬라이드 이제 설치 준비가되었습니다.
- 마지막 1X PBT는 린스 후, 부드럽게 측면 핀을 제거합니다. 표피 찢어하지 않도록주의한다.
- 조심스럽게 두 남은 핀을 제거하고 집게로 유충을 선택하고 준비 슬라이드 수평 유충을 놓으십시오. 유충이 이상의 이성을 상실하고 지향 복부 측면가 없습니다 있는지 확인하십시오.
- 부드럽게 위에 커버 용지를 놓고 (그림 참조) 매니큐어와 가장자리를 밀봉. 유충 지금은 형광 현미경으로 시각화를위한 준비가되었습니다.
7. 대표 결과
그림 1 : 야생 유형 larv에서 애벌레 segmental 신경의 대표 이미지(CSP, Zinsmaier 외. 1994) 시냅스 소포 단백질 시스테인 문자열 단백질에 대한 항체를 사용하여. segmental 신경이 원활하게 스테인드됩니다. 바 = 20μm
그림 2 : 시냅스 소포 단백질 시스테인 문자열 단백질 (CSP)에 대한 항체를 사용하여 모터 단백질 돌연변이 유충에서 애벌레 segmental 신경의 대표 이미지. segmental 신경이 CSP (화살표)에 대한 밝은 얼룩 거대한 축적을 표시합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Drosophila 애벌레 segmental 신경 axonal 교통 메커니즘을 연구하기위한 강력한 시스템입니다. 3 차 instar 애벌레의 절개가 올바르게 수행하는 경우, 등 근육과 NMJs 같은 CNS, PNS, 및 관련 조직, 모든 구성 요소는 하나의 유충 이내에 검사를하실 수 있습니다. 우리는 허드와 색스턴 (1996)에 의해 출판 하나에서이 프로토콜을 적응있다. 이 프로토콜은 다른 항체의 연결을 테스트하는 적응 될 수 있지만, 항체의 최적화 할 수 있습니다. 기본 및 보조 항체 보육 시간은 변경될 수 있습니다 또는 차단 단계는 추가할 수 있습니다. 우리는 성공적으로 아밀로이드 전구체 단백질 1과 axonal 교통 Huntingtin 2의 역할을 조사하기 위해이 프로토콜을 사용하고 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
SG는 버팔로의 뉴욕 주립 대학에서와 존 R. Oishei 재단 기금에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Minutien Pins, Stainless Steel | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Mcpherson-Vannas Straight Blade 8cm Scissors | Fisher Scientific | 50822236 | |
| Vectashield, Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Sylgard 184 Silicone elastomer | Dow Corning | 4026148 | |
| formaldehyde, 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| dCSP3 | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11004 |
References
- Gunawardena, S., Goldstein, L. Disruption of Axonal Transport and Neuronal Viability by Amyoid Precursor Protein Mutations in Drosophila. Neuron. 32 (2), 389-401 (2001).
- Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40 (1), 1-2 (2003).
- Hurd, D. D., Saxton, W. M. Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila. Genetics. 144 (3), 1075-1085 (1996).
- Zinsmaier, K. E., Eberle, K. K., Buchner, E., Walter, N., Benzer, S. Paralysis and early death in cysteine string protein mutants of Drosophila. Science. 263, 977-980 (1994).
