小龙虾腿伸肌高和低输出NMJs生理录音

Summary

本文演示了如何进行突触反应的电生理记录的伸肌在一个小龙虾腿走路和神经末梢如何可视化显示的高和低输出神经末梢总值的形态差异。

Abstract

我们详细解释如何进行揭露和高（相位）和低（补品）输出运动神经元支配伸肌在一个小龙虾腿走路的突触反应的电生理记录。在目前的阶段性和补品神经末梢的生理和形态明显的差异。进补轴突包含有更多的线粒体，使其能够采取一个重要的污点更为激烈的阶段性轴突。进补终端有静脉曲张，和阶段性的终端是丝状。进补终端突触效能低，但戏剧性的便利反应。相反，阶段性的终端在量子疗效高，但显示高频刺激突触抑郁。量子输出是衡量一个焦点macropatch电极直接放置在可视化的神经末梢。无论是阶段性和补品终端支配同一肌肉纤维，这表明，在神经元固有的分歧，而不是差逆行反馈的肌肉，帐户的形态和生理分化。

Protocol

1）导言

运动神经元沟通的一个统称作为一种神经肌肉接头（NMJ）突触的肌纤维。 NMJs可以很容易被访问，在大多数的小龙虾肌肉的准备。许多小龙虾NMJs证明非扣球兴奋性突触后电位（EPSP）的突触后树突内产生的哺乳动物的中枢神经系统或阈下的反应，在脊椎动物NMJs中指出的分级电信号（Wiersma范Harreveld，1938年，卡茨Kuffler，1946年） 。小龙虾NMJs可以作为基本突触模型的突触传递和突触分化成提供一般的见解。

一般来说，运动单位，规范动物行为的各个方面，通过突触的沟通NMJs和肌肉的属性类型。自首次观察到的螃蟹和小龙虾接近肌肉（卢卡斯，1907年，1917年）的“快速”和“慢”的肌肉收缩，类似的肌肉收缩分化已在其他小龙虾的肌肉类型，如腹部屈肌（肯尼迪和武田，1965a ，b）和肢体伸展（范Harreveld Wiersma，1936年）。 “快”收缩启动快速反应。例如，小龙虾尾翻转是一个快速的行为。 “慢”的收缩，保持动作缓慢，并帮助保持姿势（Bradacs等，1997） 。已广泛用于通讯以“快”和“慢”的肌肉收缩，“阶段性/高输出”和“补药/低产出”来形容运动神经元。在速度和肌肉收缩的时间不同的是在与突触前，在突触的结构和突触强度的差异（王等，1996 ）的一部分。肌原纤维蛋白异构体的表达是收缩的差异也很重要，但像腿伸肌，在一个特定的纤维是由两种类型的运动神经元支配的筹备工作，重点是对突触的终端差异，因为终端的份额相同的靶细胞（Mykles等，2002） 。早先的研究中研究的腿伸了两个兴奋的运动轴突和描述的阶段性和补品的表型 （Bradacs等， 1997）。在这份报告中，我们将演示如何进行清扫和取得的录音，以便其他人可以进一步探讨这些神经末梢的突触分化的属性。

观看与透射电子显微镜，各种系列的小龙虾腿伸肌肉的补品和阶段性终端获得的部分透露，补虚终端包含更多的定价比阶段性终端水泡;线粒体中较为多见，在进补的神经元，并阶段性终端的突触更复杂的比那些低产出突触，因为它们包含多个活动区，具有不同间距“（Miller等，2002年，斯通等，2008; King等，1996;。Bradacs等，1997 ）。低输出进补终端也阶段性终端（Cooper 等人 ，2003年）相比，更容易加强与突触传递神经调节血清素（5 -羟色胺） 。

事实上，补品和阶段性NMJ相同的肌纤维上，可以更容易地评估对一个给定的肌纤维突触前的差异，肌肉疲劳，抑郁症的突触和突触的串扰问题。各种问题仍有待解决，如是否有在突触后受体的密度和谷氨酸受体亚型在突触后进补和阶段性的终端目标的差异，在此准备，但一个更好地了解这些在解剖和生理的根本区别两个电机的单位，将有助于建立更深厚的知识基础。希望是突触准备在此学到的基本原则将适用于其他各项准备工作突触，并会加强在这个小龙虾的突触模型的未来调查。

2）方法

1. 所有的实验都进行中型龙虾（ 克氏螯虾 ）的第一或第二的步行腿。动物被单独安置在与oxygenized水的塑料容器。动物房温度范围在13 ° C - 16 ° C。动物们喂干鱼食和每周一次的基础上改变了水。

   
   图1：一个小龙虾步行腿和6个远段的原理图。

2. 在小龙虾腿走路的远端方面在解剖学上分为6段（图1）。位于小腿伸meropodite，将被隔离的神经束，接近meropodite ischiopodite联合。补药或阶段性的轴突可以Ë选择性地刺激需要后，他们所承受的生理目的。
3. Cooper和Cooper（2009）描述的初始剥离的一些方面，包括揭露meropodite地区内的揭幕战中运动神经元励磁的方法，但他们的描述不提供保护免受损害伸肌所需的照料，因为它是没有需要解决的开门红肌肉准备。为了保护伸，第一或第二的步行腿的小龙虾从，测量体长6-10厘米（阿查法拉亚生物供应公司，Raceland，LA），通过诱导动物肢体有力捏automize远端ischiopodite段骨折平面。腿放在夹层板与侧（外侧）面对观众。腿转身，直到观众可以肯定外（外侧）朝上夹层板，通常与拱形侧（图2）。配售一块纸巾的腿，使得更容易打开的准备，而这些削减。

   
   图2：侧方的meropodite，通常是拱形侧，是夹层板朝上..

4. 用手术刀刀片断路器和持有人，一个锋利的刀片是用来蚀刻的角质层，直到刚刚切割meropodite段在图3所示的模式通过。护理是采取不削减太远meropodite carpopodite联合远端背侧腹侧切开。

   
   图3：行作为建议图案蚀刻角质层窗口meropodite段。

   放置在盐水的准备工作。解剖盘应该有一个底部Sylgard（道康宁）涂层（厚1cm）。Sylgard是用于使昆虫引脚可分为卡仍然持有的准备。在这一点上，脚被卡在中间的carpopodite部分，并在背方面ischiopodite段（图4）。解剖的准备沐浴在标准的小龙虾生理盐水，范Harreveld的解决方案（1936年），这是205氯化钠修改; 5.3KCl; 13.5 _{氯化钙2 ·} 2H ₂ O; 2.45 _{氯化镁2 ·} 6H ₂ O 5 HEPES和调整，以pH值7.4（毫米）。

   
   图4：削减窗口meropodite段升空。注意解剖引脚的位置。

5. 在远端地区的角质层轻轻地抬起和肌纤维被切断从角质层，对基地的腿招。角质层可以升空。
6. 在meropodite carpopodite联合apodeme（肌腱）被切断。一针放在屈肌腱的内表面切（图5）。这是削减用镊子退出解除在尾方向（图6），暴露的主要腿部神经和伸肌和屈肌肌腱，然后捏。

   
   图5：屈肌apodeme取代用大头针屈突出。

   
   图6：屈肌apodeme被切断，小心拆除，以免损坏主要小腿神经。

7. 主要的腿神经被切断meropodite carpopodite联合，并仔细地拉了过来伸肌回。内侧肌肉的表面是在本研究中使用。从主小腿神经伸肌的神经分离，可以提高轻轻拉动的主要腿部神经的远侧断端一侧的准备。剥离时伸肌主要小腿神经轴突的小树枝可能需要削减。这些都是从抑制运动神经元伸肌分支。较大的分支从附近的meropodite近端的小腿神经丛是利益的小神经束。

   
   图7：主要的腿神经被切断，近端方向拉。

   可以看出，这种神经束与亚甲基蓝染色（图8）或4 - DI - 2 - ASP荧光染色（图9）。

   
   图8：伸肌与亚甲蓝染色。注意轴突的分支和两个随时可见的神经轴突内。红色箭头丹麦的神经轨道。

   
   图9：4 - DI - 2 - ASP的运动神经染色轴突。进补轴突是由于线粒体含量增加更明亮可见。

   
   图10A：4 - DI - 2 - ASP的染色的阶段性和补品神经元的个人终端。请注意进补终端和薄性质的阶段性终端膨体。

   
   图10B构造说

   
   图10C -阶段性指出

3）生理资料

1. 要观察的补药或阶段性的神经元的兴奋性突触后电位（EPSPS），孤立的轴突在神经束之一是刺激吸草刺激电极连接（图11），而在肌肉细胞内的潜力监测（斯通等 ，2008）。在70 Hz的刺激，以促进为低输出NMJs促进救灾，适用于补虚轴突或单脉冲（1赫兹）是适用于阶段性的轴突，以获得高输出大EPSPS NMJs如图所示在图12。 EPSPS都记录到计算机通过PowerLab/4s接口。

   
   图11：刺激电极放置在一个单一的神经束内的轴突。注意绿线概述2主轴突。

   
   图12：补药或阶段性的神经元细胞内的录音获得的突触后电位（EPSPS ）。

2. 在促进突触和突触抑郁性质的调查，可以接触各种实验范式与低，产量高NMJs。便利的低输出NMJs取决于频率，为约20刺激（图13）20，40和60赫兹脉冲所示。

   
   图13：在响应了三种不同的频率20，40和60赫兹在正常的小龙虾生理盐水刺激脉冲的培养EPSPS。

3. 突触抑郁率的刺激频率也与高输出NMJs。图14显示了连续5赫兹的刺激郁闷NMJ超过30分钟。随着刺激频率较高，准备将抑制更为迅速（Bradacs 等 ，1997年）。

   
   图14：EPSP的幅度在5 Hz的刺激诱 ​​发抑郁症的阶段性反应。

4）量子反应

1. 一个开门红肌肉小龙虾（Cooper和Cooper，2009）中描述的类似的程序是用于在此准备。直接通过识别区域的神经末梢量子EPSPS记录放在宏观补丁记录电极对突触膨体流明，具有重要的染料4 -二- 2 - ASP（5微米，5分钟的治疗 ，Cooper等可视化，1995; Magrassi 等 ，1987）。可以记录沿神经末梢自发以及诱发量子反应。诱发和自发突触电位记录与宏观补丁电极（Dudel，1981;武伊托维奇等 ，1991;。Mallart，1993年）。 Kimax玻璃（外径：1.5毫米），被拉到和火抛光生产内径从10到20微米（图15）的补丁提示。

   
   图15：宏观补丁的记录电极流明..

   电极内腔充满了沐浴液。该放大器是上述细胞内的录音中使用的相同。通过测试电流脉冲通过电极，电极和密封性能，可确定。在我们的实验中，密封电阻范围从0.3至1.0毫欧和电极电阻从0.5至1.0毫欧不等。密封电阻可以监视整个录音。

2. 量子事件的直接计数可能与低刺激的频率。量子事件对于每个诱发反应，可以很容易地确定为低输出端子（FigurE 16）。这些直接计数，可以帮助估计平均量子含量（德尔卡斯蒂略卡茨，1954年，Cooper 等人，1995年） 。由于诱发的高输出NMJs产生多量子诱发事件，平均振幅或地区的挠度，平均峰值振幅或面积自燃事件，可用于近似的平均量子含量 （Cooper等人。 1995年）。

   
   图16焦距的痕迹，记录从一个阶段性和一剂强心剂NMJ 。

   
   图17

Discussion

我们已经证明，在这份报告中，如何剖析，记录和量化在一个独特的小龙虾神经肌肉的准备，在高和低输出端子支配的肌纤维突触反应。在小龙虾的神经肌肉筹备工作提供了超过脊椎动物神经肌肉交界处的许多优点，因为只有少数的兴奋性运动神经元支配的肌肉，而且因为神经元是从准备到识别的准备（阿特伍德，1976）。此外，兴奋性神经递质谷氨酸，和分级的兴奋性突触后电位（EPSP），因此，分级事件的生物物理特性类似于脊椎动物的中枢神经系统内神经元的树突。然而，量子电流，可以直接监测在突触后的网站（Cooper 等人 ，1995年）。

重复5赫兹的阶段性神经刺激产生几分钟后，成为大大郁闷的大EPSPS。这种类型的抑郁症是常见于节肢动物阶段性的神经肌肉接头（阿特伍德和库珀，1996）。旁边的阶段性终端的补药终端的存在，允许一个突触后的目标是评估是否大大阶段性的运动神经元的抑郁症，期间和之后的修改。此外，低输出端子提供了一个很好的准备，调查机制的基础突触便利（2008年德赛- Shah 等人，;。德赛Shah和库珀，2009 ）

高输出端子提供了一个发挥地面调查突触抑郁症和恢复过程的速度调制。访问和活菌制剂，应帮助破译突触抑郁症背后的机制。在这个小龙虾腿伸准备，外源性羟色胺的应用，是另一种工具来调查突触抑郁症和潜在的进一步调查动员进入突触小泡池的手段恢复。这种准备提供了几个实验的优势，因为个人的阶段性和补品的运动神经元支配的肌纤维。

由于血清素增加，诱发刺激释放的囊泡数量，因为它促进在抑郁症的恢复，很明显，有一些小泡池，为加强与融合的可能性-羟色胺目前的调制（约翰斯顿等人，2008年劳格斯登等，2006;火花等，2004）。低频刺激，而不是一个低迷的状态，这可以解释在突触前神经末梢的囊泡池的动态模型还需要考虑这种准备可能的实验之间的各种协议。

人们已经注意到，在其他系统中，约30％的小泡池，经历了一个快速的回收利用，而其余的回收囊泡通过内质网（Harata等，2001;。钱学森等人通过传统的缓慢回收路径。 ，2001）。这种双重路径，也可以在这个系统中存在。如果ATP是缺乏在突触前终端的低迷状态，然后对接和脱开可能无法出现，因此，许多卸载囊泡停留在表面的突触。由于越来越多的小泡是迅速释放终端接触到5羟色胺，它是可行的，更多的是易释放池（RRV）内所载。然而，在低迷的状态，与减少ATP的对接和脱开可能受阻，甚至在5羟色胺，再次离开卸载囊泡在突触表面的存在。由于初步数据表明，随着时间的推移释放更多的囊泡延长5羟色胺的暴露和刺激，小泡池分布的快与慢的回收路径可能是倾斜的主管重新释放囊泡 （斯通等。 ，2008;评论德赛- Shah 等人，2008;德赛Shah和库珀，2009）

随着性突触后电流和措施，从运动神经终端的定义的地区单量子联络macropatch录音技术，可以提问，以确定是否突触抑郁症是作为一个被释放的囊泡的结果，或者因为改动的功能发生突触后受体。它已被证明的囊泡平等钙曝光（Miller 等人在这个准备的阶段性NMJ融合更为敏感 。2005年），这可能占较高意味着量子阶段性终端（Msghina等内容 。 1998年，1999年）。此外，中的钙结合蛋白frequenin的差异（Jeromin等 ，1999）和超微结构（King等，1996）作出贡献的差突触效能（库珀等，2003）。

一些以前的研究探索的伸肌的肌肉纤维表型（Bradacs等人 ，1997 年 ，Cooper 等人 ，2003 年 ） 。肌肉分化调节混合纤维类型的小龙虾，纯粹是补药和阶段性的光纤类型，比较喜欢钝地支配小腿伸，可以提供线索，肌表型的表达和调控（LaFramboise等，2000 ;孙某等。 人，2000年Griffis 等，2001; Mykles 等，2002）。

许多根本性的问题有待解决在神经生物学，该制剂可能有助于解决其中一些。在该领域的兴趣今天的一个，可能是的腿伸上前几个主题包括：1）确定的细胞机制，基础在高输出终端突触抑郁症（抑郁由于减少钙+入门，缺乏主管易释放囊泡（RRV）池，和/或改变突触后的接受吗？）2）确定的5 - 羟色胺的机械作用后，诱导突触抑郁症的应用，以促进更快的复苏，以及3）确定是否量子形状从刺激阶段性终端产生的电流，正在改变在抑郁症的感应，解决突触抑郁前和突触后成分。

这NMJ正在进行的研究和未来的调查是非常重要的，因为它使我们能够获得相关信息，解决机制，在释放地点直接测量突触的性能下属。目前这方面的研究提供5 - 羟色胺和小泡池的动态调制突触抑郁症有关的信息。等议题涉及到有关的所有神经系统的突触传递的根本基础。

Materials

Crayfish (Procambarus clarkii). Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA., USA. Standard crayfish saline: Modified from Van Harreveld's solution (1936). (in mM) 205 NaCl; 5.3 KCl; 13.5 CaCl22H2O; 2.45 MgCl26H2O; 5 HEPES and adjusted to pH 7.4 Dissection tools: Fine #5 tweezers, fine scissors, knife blade holder, #26002-20 insect pins (all obtained from Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139) Sylgard coated dissection dish, a recording dish either constructed with suction electrode or use a suction electrode and anther manipulator to hold a suction electrode. Dissecting microscope with zoom function for intracellular recordings. For focal recording on visualized terminals a compound microscope with upright objectives (4 x and 20X) is used. One needs a Hg light source. Standard intracellular amplifier and A/D board for on line recording to a computer. Electrical signals are recorded on line to a PowerLab/4s interface (ADInstruments, Australia). We use standard software from ADInstruments named Chart or Scope. Chemicals: We use a vital fluorescent dye, 4 [4 (diethylamino) styryl] N methylpyridinium iodide (4 Di 2 Asp; Molecular Probes, Eugene, OR), to visualize the varicosities (Marigassi et al., 1987; Cooper et al., 1995a). All saline chemicals were obtained from Sigma chemical company (St. Louis, MO). For intracellular recordings we use glass capillary tubing (catalogue # 30-31-0 from FHC, Brunswick, ME, 04011, USA) and for focal macropatch electrodes we use Kimax-51, Kimble Products Art. No. 34502, ID 0.8-1.1mm, length 100mm. The intracellular electrode should have a resistance of 20 to 30 mOhm. The macropatch electrode is constructed by breaking off the tip of the glass after a fine tip was made from an electrode puller. The broken off tip needs to be a clean perpendicular break about 20μM in diameter. The tip is then heat polished to about 10μM inner diameter. The shaft of the electrode is then run over a heating element to cause it to bend about 45 degrees with a gradual bend. This produces a flat or perpendicular electrode lumen over the nerve terminal as the angle with the micro-manipulator will produce about another 45 degrees to the preparation.