Physiologische Aufnahmen von High-und Low Output NMJs auf der Crayfish Leg Streckmuskel

Summary

Dieser Artikel beschreibt, wie elektrophysiologischen Ableitungen der synaptischen Antworten auf die Extensoren Verhalten in den Fuß Bein eines Krebse und wie die Nervenendigungen werden visualisiert, um die Brutto-morphologischen Unterschiede von High-und Low-Output-Nervenendigungen zeigen.

Abstract

Wir erklären im Detail, wie zu entlarven und zu leiten elektrophysiologischen Ableitungen der synaptischen Antworten für hoch (phasischen) und niedriger (Tonika) Ausgang Motoneuronen innervieren die Extensoren in den Fuß Bein eines Krebse. Deutliche Unterschiede sind in der Physiologie und Morphologie der phasischen und tonischen Nervenendigungen. Das Tonikum Axon enthält viele mehr Mitochondrien, so dass es einen wichtigen stärker als die phasischen Axon Fleck. Das Tonikum Terminals haben Krampfadern, und der phasischen Terminal ist fadenförmig. Das Tonikum-Terminals sind in der synaptischen Effektivität niedrig, aber zeigen dramatische erleichtert Antworten. Im Gegensatz dazu sind die phasischen Terminals in quantal Wirksamkeit hoch, aber zeigen synaptische Depression mit hoher Frequenz Stimulation. Die quantal Ausgang ist mit einer Brennweite macropatch Elektrode direkt über die visualisierte Nervenendigungen platziert gemessen. Beide phasischen und tonischen Terminals innervieren die gleichen Muskelfasern, die inhärenten Unterschiede in den Neuronen, anstatt Differential retrograde Feedback von den Muskeln, Konto für die morphologische und physiologische Differenzierung schlägt.

Protocol

1) Einführung

Motor Neurone mit einer Muskelfaser an Synapsen, die gemeinsam als neuromuskulären Synapse (NMJ) bezeichnet kommunizieren. NMJs kann leicht in den meisten Krebse Muskel Vorbereitungen zugegriffen werden. Viele der Krebse NMJs demonstrieren nicht spiking exzitatorischen postsynaptischen Potentiale (EPSP) ähnlich wie die abgestufte elektrische Signale in postsynaptischen Dendriten innerhalb der Säuger-ZNS-oder unterschwelligen Reaktionen in Vertebraten NMJs angemerkt erzeugt (Wiersma & Van Harreveld, 1938; Katz & Kuffler, 1946) . Die Krebse NMJs kann als grundlegende synaptischen Modelle dienen dazu, allgemeine Einsichten in die synaptische Übertragung und synaptischen Differenzierung.

Im Allgemeinen regeln motorischen Einheiten Aspekte des Verhaltens von Tieren über die Art der synaptischen Kommunikation NMJs und Eigenschaften der Muskeln. Seit der ersten Beobachtung von "schnell" und "langsame" Muskelkontraktionen in Krabben und Krebse näher Muskel (Lucas, 1907, 1917), hat ähnliche muskuläre Kontraktion Differenzierung in andere Krebse Muskel-Typen wie Bauch-Beuger (Kennedy & Takeda, 1965a beschrieben worden , b) Leib und Strecker (Van Harreveld & Wiersma, 1936). "Fast" Wehen einleiten schnellen Antworten. Zum Beispiel ist die Krebse Schwanz Flip eine schnelle Verhalten. "Slow" Kontraktionen zu erhalten langsamen Bewegungen und zur Erhaltung der Haltung (Bradacs et al., 1997). Entsprechend "schnell" und "langsame" Muskelkontraktionen, "phasischen / high output" und "tonisch / low output" werden allgemein die motorischen Neuronen zu beschreiben. Der Unterschied in der Geschwindigkeit und der Zeitpunkt der Muskelkontraktion ist zum Teil im Zusammenhang mit präsynaptischen Unterschiede in der synaptischen Struktur und synaptischen Stärke (King et al., 1996). Myofibrilläre Protein-Isoform-Expression ist auch in kontraktilen Unterschiede wichtig, aber in Vorbereitung wie die des Beines Streckmuskel, in dem eine bestimmte Faser, die durch beide Arten von Motoneuronen innerviert ist, liegt der Fokus auf die synaptische Unterschiede der Terminals, da die Terminals Aktien die gleiche Zielzelle (Mykles et al., 2002). Eine frühere Studie untersuchten die beiden erregenden motorischen Axone des Beines extensor und beschrieb die phasischen und tonischen Phänotypen (Bradacs et al., 1997). In diesem Bericht zeigen wir, wie man die Zerlegung durchführen und erhalten Aufnahmen, so dass andere weiter zu untersuchen, können die Eigenschaften der synaptischen Differenzierung dieser Nervenendigungen.

Betrachtet mit Transmissions-Elektronenmikroskopie, verschiedene Reihe von Abschnitten aus der tonische und phasische Terminals auf Krebse Bein Streckmuskel erhalten ergaben, dass Tonic Terminals mehr RRP Vesikel als phasische Terminals enthalten, die Mitochondrien sind häufiger in tonische Neuronen und Synapsen auf phasische Terminals sind komplexer als die der Low-Output-Synapsen, da sie enthalten mehrere aktive Zonen mit unterschiedlichen Abständen (Miller et al, 2002; Johnstone et al, 2008;. King et al, 1996;.. Bradacs et al, 1997). Die Low-Output-Tonic-Terminals sind auch anfälliger für die Verbesserung der synaptischen Übertragung mit dem Neuromodulator Serotonin (5-HT) als die phasischen Terminals (Cooper et al., 2003).

Die Tatsache, dass die tonische und phasische NMJ auf dem gleichen Muskelfasern sind erleichtert präsynaptischen Unterschiede auf einer bestimmten Muskelfaser zu bewerten und zu Fragen der Muskelermüdung, synaptische Depression und synaptische Übersprechen Adresse. Verschiedene Fragen müssen noch in diesem Präparat behandelt werden, wie zum Beispiel, ob es Unterschiede in der postsynaptischen Rezeptor-Dichte und Glutamat-Rezeptor-Subtypen in postsynaptischen Ziele für die tonische und phasische Terminals, sondern ein besseres Verständnis der grundlegenden Unterschiede in der Anatomie und Physiologie dieser zwei Motor-Einheiten werden in den Aufbau einer tieferen Wissensbasis zu unterstützen. Die Hoffnung ist, dass die grundlegenden Prinzipien in dieser synaptischen Vorbereitung gelernt werden auf andere Synapsen in verschiedenen Zubereitungen und zukünftige Untersuchungen in diesem synaptischen Modell des Krebses zu erhöhen.

2) Die Methoden

1. Alle Experimente werden auf der ersten oder zweiten Laufbeinen mittelständischer Krebse (Procambarus clarkii) durchgeführt. Die Tiere werden einzeln in Kunststoff-Behälter mit oxygenized Wasser untergebracht. Die Temperatur des Tieres Zimmer liegt im Bereich von 13 ° C-16 ° C. Die Tiere sind mit einem trockenen Fischfutter und das Wasser auf einer wöchentlichen Basis geändert zugeführt.

   
   Abbildung 1: Schematische Darstellung eines Krebse Fuß Bein und den sechs distalen Segmente.

2. Der distale Aspekt der Fuß Bein in einem Flusskrebs ist anatomisch in sechs Segmente (Abbildung 1) eingeteilt. Das Bein extensor ist in der meropodite befindet, und das Nervenbündel, das isoliert sein wird, ist in der Nähe des meropodite ischiopodite Gelenk. Das Tonikum oder phasische Axon kann be selektiv stimuliert wie für physiologische Zwecke benötigt, nachdem sie ausgesetzt sind.
3. Cooper und Cooper (2009) beschrieb einige Aspekte der ersten Sektion, einschließlich der Methoden für das Freilegen der Erreger des Openers Motoneuronen im meropodite Region, aber ihre Beschreibung nicht die Sorge für den Schutz der Extensoren von Schäden erforderlich ist, wie es war nicht erforderlich, um den Opener Muskel-Präparat Adresse. Um die extensor zu schützen, ist die erste oder zweite Fuß Bein von der Krebse entfernt, Mess 6-10 cm Körperlänge (Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA), durch die Induktion des Tieres auf die Gliedmaßen mit kräftigen Kneifen automatisieren distal der Bruchfläche in der ischiopodite Segment. Das Bein wird auf die Präparation Platte mit den seitlichen (Außenseite) dem Betrachter zugewandt platziert. Das Bein ist rund, bis der Betrachter sicher sein können, nach außen (lateral) Seite nach oben auf die Zerlegung Platte, in der Regel mit der gewölbten Seite nach oben (Abbildung 2) eingeschaltet. Aufstellen des Beins auf einem Stück Seidenpapier erleichtert die Vorbereitung wiederum während Sie diese Kürzungen.

   
   Abbildung 2: Die Außenseite des meropodite, in der Regel die Seite, ist gewölbt, nach oben auf die Zerlegung Platte ..

4. Mit einem Skalpell Leistungsschalter und Halter, ist eine scharfe Rasierklinge zu ätzen die Kutikula bis kurz Durchtrennen in das Muster in Abbildung 3 für die meropodite Segment ausgewiesen werden. Es wird darauf geachtet, nicht zu weit distal an der dorsalen Schnitt nach ventral Schnitt durch die meropodite-carpopodite Gelenk.

   
   Abbildung 3: Die meropodite Segment mit Zeilen wie eine vorgeschlagene Muster für das Ätzen aus dem Fenster der Nagelhaut.

   Die Zubereitung ist in Kochsalzlösung gelegt. Die Dissektion Gericht sollte eine Sylgard (Dow Corning)-Beschichtung auf der Unterseite (1 cm dick). Die Sylgard so verwendet wird, das Insekt Stifte in kann für die Abhaltung der Vorbereitung noch beklebt werden. An dieser Stelle ist ein Stift in der Mitte des carpopodite Segment und in der Dorsalseite des ischiopodite Segment (Abbildung 4) stecken. Dissected Vorbereitungen sind in Standard-Krebse Kochsalzlösung getaucht, modifiziert nach Van Harreveld s Lösung (1936), die mit 205 NaCl hergestellt wird; 5.3KCl; 13,5 CaCl _2; 2H ₂ O, 2,45 MgCl _2; 6 H ₂ O, 5 HEPES und angepasst pH 7,4 (in mm).

   
   Abbildung 4: Die meropodite Segment mit geschnittenen Fenster abgehoben wird. Beachten Sie die Lage der Dissektion Pins.

5. Die Nagelhaut wird sanft in den distalen Bereich angehoben und die Muskelfasern sind weg von der Nagelhaut, indem sie Schläge auf der Basis des Hosenbein. Die Nagelhaut kann abgehoben werden.
6. Die apodeme (Sehne) am meropodite-carpopodite gemeinsame geschnitten. Ein Stift ist an der inneren Oberfläche der Beugesehne, um zu zeigen, wo der Schnitt gemacht (Abbildung 5) platziert werden. Die Sehne wird dann gekniffen, wo sie mit einer Pinzette und die Beugemuskeln zog, indem Sie ihn in einem kaudal (Abbildung 6), Freilegung der Hauptlauf Nerven und die Extensoren geschnitten wurde.

   
   Abbildung 5: Die apodeme der Beugemuskeln ist, durch Verschieben der flexor mit einem Stift markiert.

   
   Abbildung 6: Die apodeme der Beugemuskeln abgeschnitten und entfernt mit Vorsicht, da nicht der Hauptlauf Nervenschäden.

7. Der Hauptlauf Nerv an der meropodite-carpopodite gemeinsame geschnitten und sorgfältig wieder über die Extensoren gezogen. Die mediale Fläche des Muskels wird in dieser Studie verwendet. Die Trennung der Nerven auf die Extensoren von den Hauptlauf Nerv kann durch leichtes Ziehen am distalen Stumpf der Hauptlauf Nerven an der Seite des Präparats erhöht werden. Beim Schälen der Hauptlauf Nerven wieder über die Extensoren, können kleine Äste von Axon müssen geschnitten werden. Diese sind Zweige von den hemmenden motorischen Neurons auf die Extensoren. Die größeren Bündel abzweigt aus dem Hauptlauf Nerven in der Nähe des proximalen Endes des meropodite ist das kleine Nervenbündel von Interesse.

   
   Abbildung 7: Der Hauptlauf Nerv geschnitten und wieder in eine proximale Richtung gezogen.

   Das Nervenbündel mit Methylenblau-Färbung (Abb. 8) oder mit gesehen werden 4-Di-2-ASP Fluoreszenzfarbstoff (Abbildung 9).

   
   Abbildung 8: Die Extensoren mit Methylenblau gefärbt. Beachten Sie das Axon verzweigt und diezwei leicht sichtbar Axone im Nerv. Rote Pfeile demark den Nerv zu verfolgen.

   
   Abbildung 9: Die Axone der motorischen Nerven gefärbt mit 4-Di-2-ASP. Das Tonikum Axon ist strahlend sichtbar aufgrund der erhöhten mitochondrialen Inhalt.

   
   Abbildung 10A: Individual-Terminals der phasischen und tonischen Neuronen mit 4-Di-2-ASP gefärbt. Notieren Sie sich die Krampfadern auf der Tonika-Terminals und die dünne Beschaffenheit der phasischen Terminals.

   
   Abbildung 10B-Tonic beachten

   
   Abbildung 10C-Phasische beachten

3) Physiologische Profile

1. Zur Wahrung der exzitatorischen postsynaptischen Potentiale (EPSPs) der Tonika oder phasische Neuronen, ist einer der isolierten Axone im Nerven-Bündel durch eine Saug-Elektrode (Abbildung 11) verbunden mit einem Grass-Stimulator stimuliert, während intrazellulären Potentiale im Muskel überwacht werden (Johnstone et al., 2008). Stimulation bei 70 Hz ist die Tonika Axon angewandt, um eine erleichterte Reaktion für die geringe Leistung NMJs zu fördern, oder ein einzelner Impuls (1 Hz) ist die phasische Axon angewendet, um große EPSPs der hohe Leistung zu erhalten NMJs wie gezeigt in Abbildung 12. Die EPSPs werden an einen Computer über ein PowerLab/4s Schnittstelle aufgezeichnet.

   
   Abbildung 11: Stimulationselektrode über ein einzelnes Axon innerhalb der Nerven-Bündel gelegt. Beachten Sie die grüne Linie, in der die 2 wichtigsten Axone.

   
   Abbildung 12: postsynaptischen Potentiale (EPSPs) der Tonika oder phasische Neurone durch intrazelluläre Ableitungen erhalten.

2. Untersuchung in der Natur der synaptischen Erleichterung und synaptische Depression kann durch verschiedene experimentelle Paradigmen mit dem Low-und High-Ausgang NMJs angefahren werden. Erleichterung der geringen Leistung NMJs hängt von der Frequenz, wie für die 20, 40 und 60 Hz Impulsen von etwa 20 Reize (Abbildung 13) dargestellt.

   
   Abbildung 13: EPSPs in Reaktion auf einen Zug von Stimulationsimpulsen bei drei verschiedenen Frequenzen 20, 40 und 60 Hz in normalen Krebse Kochsalzlösung verabreicht.

3. Die Rate der synaptische Depression auf die Frequenz der Stimulation ist auch die hohe Leistung NMJs verwandt. Abbildung 14 zeigt einen kontinuierlichen 5 Hz Stimulation Drücken der NMJ über 30 min. Bei höheren Stimulationsfrequenz, wird die Vorbereitung schneller drücken (Bradacs et al., 1997).

   
   Abbildung 14: EPSP Amplitude der phasischen Reaktion während 5 Hz Stimulation Depressionen auslösen.

4) quantal Responses

1. Ein Verfahren ähnlich wie bei dem Opener Muskeln des Krebses (Cooper und Cooper, 2009) beschrieben wird, in dieser Zubereitung verwendet. Die quantal EPSPs direkt über identifizierbare Regionen der Nervenendigung werden, indem das Lumen eines Makro-patch Aufnahme Elektrode auf die synaptische Krampfadern aufgezeichnet visualisiert mit den vitalen Farbstoff 4-Di-2-Asp (5 uM, 5-min-Behandlung, Cooper et al, 1995;. Magrassi et al, 1987).. Die spontane sowie evozierte quantal Antworten können entlang der Nervenendigungen aufgenommen werden. Die evozierte und spontane synaptische Potentiale sind mit der Makro-Patch-Elektrode (Dudel, 1981; Wojtowicz et al, 1991;. Mallart, 1993) erfasst. Kimax Glas (Außendurchmesser: 1,5 mm) gezogen wurde und Feuer-poliert, um Patch-Tipps mit Innen-Durchmessern von 10 bis 20 um (Abbildung 15) zu produzieren.

   
   Abbildung 15: Das Lumen eines Makro-patch Aufnahme Elektrode ..

   Das Lumen der Elektrode ist mit dem Bade Medium gefüllt ist. Der Verstärker ist die gleiche wie die für die intrazelluläre Aufnahme oben genannten verwendet. Elektrode und Dichtung Widerstand kann durch das Bestehen der Prüfung Stromimpulse durch die Elektrode bestimmt werden. In unseren Experimenten lagen Abdichtwiderstande 0,3 bis 1,0 MOhm und die Elektrode Widerstand reichte von 0,5 bis 1,0 MOhm. Seal Widerstand kann während der Aufnahme kontrolliert werden.

2. Direkte Zählung der quantal Ereignisse mit geringer Stimulation Frequenzen möglich. Für jede evozierte, kann die Anzahl der quantal Ereignisse ohne weiteres für die geringe Ausgangsklemmen bestimmt werden (Figure 16). Diese direkten zählt helfen Schätzung der mittleren quantal Inhalt (Del Castillo & Katz, 1954;. Cooper et al, 1995). Da die evozierten hohe Leistung NMJs multi-quantal evozierten Ereignisse, die mittlere Amplitude oder Gebiet der Ausschläge, zusammen mit der durchschnittlichen Amplitude oder Gebiet der spontanen Ereignisse zu produzieren, kann die Angleichung der mittleren quantal Inhalt (Cooper et al verwendet werden., 1995).

   
   Abbildung 16 Focal Spuren von einer phasischen und tonischen NMJ aufgezeichnet.

   
   Abbildung 17

Discussion

Wir haben in diesem Bericht gezeigt, wie zu sezieren, aufzuzeichnen und zu quantifizieren synaptischen Antworten in einer einzigartigen Krebse neuromuskuläre Vorbereitung, in denen beide High-und Low-Ausgänge innervieren die gleichen Muskelfaser. Die neuromuskuläre Präparate in die Krebse bieten viele Vorteile gegenüber Wirbeltieren neuromuskulären Verbindungen, da nur wenige exzitatorischen Motoneuronen benötigt werden, um einen Muskel innervieren, und da die Neuronen erkennbar von der Vorbereitung bis Vorbereitung (Atwood, 1976). Darüber hinaus ist die erregenden Neurotransmitters Glutamat, und die exzitatorischen postsynaptischen Potentiale (EPSP) werden benotet, daher werden die biophysikalischen Eigenschaften von abgestuften Veranstaltungen analog zu den Dendriten der Neuronen im ZNS der Wirbeltiere. Die quantal Ströme können aber direkt an der postsynaptischen Websites (Cooper et al., 1995) überwacht werden.

Repetitive 5 Hz Stimulation der phasischen Nerven führt zu großen EPSPs, die sich stark nach einigen Minuten werden depressiv. Diese Art der Depression ist häufig bei Arthropoden phasischen motorischen Endplatten (Atwood und Cooper, 1996). Die Anwesenheit der Tonika-Terminals neben der phasischen Terminals erlaubt es, festzustellen, ob die postsynaptische Ziel stark während und nach der Depression der phasischen motorischen Neurons verändert. Darüber hinaus bieten die niedrigen Ausgangsklemmen eine schöne Vorbereitung auf die Mechanismen, die synaptischen Erleichterung zugrunde zu untersuchen (Desai-Shah et al, 2008;. Desai-Shah und Cooper, 2009)

Die hohe Leistung Terminals bieten einen Spielplatz der Modulation in Höhe von synaptische Depression und die Recovery-Prozess zu untersuchen. Zugänglich und lebensfähigen Präparate sollten bei der Entschlüsselung der Mechanismen, die hinter synaptische Depression zu helfen. In dieser Krebse Bein extensor Vorbereitung ist exogene Applikation von Serotonin ein weiteres Werkzeug zur Wiederherstellung von synaptische Depression und möglicherweise ein Mittel zur Förderung der Erforschung der Mobilisierung der synaptischen Vesikel-Pools zu untersuchen. Dieses Präparat enthält mehrere experimentelle Vorteile, da die einzelnen Muskelfasern von beiden phasischen und tonischen Motoneuronen innerviert.

Da Serotonin erhöht die Anzahl der Vesikel, die mit evozierten Stimulation freigesetzt werden, und da es Genesung fördert während der Depression, ist es offensichtlich, dass es einige Modulation der Vesikel-Pools für die Verbesserung der Wahrscheinlichkeit der Fusion mit Serotonin vorhanden ist (Johnstone et al., 2008 ; Logsdon et al, 2006;. Sparks et al, 2004).. Modelle, die die Dynamik der Vesikel-Pools innerhalb der präsynaptischen Nervenendigung erklären während niederfrequente Stimulation, um eine depressive Zustand entgegen, müsste auch unter den verschiedenen experimentellen Protokollen, die möglich sind mit diesem Präparat in Betracht gezogen werden.

Es hat in anderen Systemen wurde festgestellt, dass etwa 30% der Vesikel-Pool eine schnelle Wiederverwertung unterzogen wird, während der Rest der Recycling-Vesikel durch einen traditionellen langsamen Recycling Weg gehen durch das endoplasmatische Retikulum (Harata et al, 2001;. Tsien et al. , 2001). Solche Dual-Pfade können auch vorhanden sein in diesem System. Wenn ATP im gedrückten Zustand der präsynaptischen Terminal fehlt, dann An-und Abdocken möglicherweise nicht eintreten, und so viele mehr entladen Vesikel würde bei der synaptischen Oberfläche bleiben. Seit mehr Vesikel schnell freigesetzt werden, wenn die Terminals 5 HT ausgesetzt sind, ist es denkbar, dass mehr in die leicht lösbare Pool (RRV) enthalten sind. Doch im gedrückten Zustand mit reduziertem ATP, kann die An-und Abdocken sogar in Gegenwart von 5-HT, die wieder verlässt entladen Bläschen an der synaptischen Oberfläche blockiert werden. Da die vorläufigen Daten deuten darauf hin, dass mehr Bläschen im Laufe der Zeit sind mit verlängerten 5 HT Belichtung und Stimulation, die Verteilung der Vesikel-Pool von der schnellen und langsamen Recycling Pfade können verzerrt an die zuständigen Vesikel für re-release (von Johnstone et al freigegeben werden. , 2008, siehe Testberichte-Desai-Shah et al, 2008;. Desai-Shah und Cooper, 2009)

Mit den Techniken der Schwerpunkt macropatch Aufnahmen von postsynaptischen Ströme und Maßnahmen der einzelnen Quanten aus definierten Regionen des motorischen Nerven Terminal kann man Fragen stellen, um festzustellen, ob synaptische Depression als Folge von weniger Vesikel freigesetzt oder wegen Veränderungen der Funktion auftretenden von postsynaptischen Rezeptoren. Es hat sich gezeigt, dass die Vesikel empfindlicher auf Fusion am phasischen NMJ dieser Zubereitung für eine gleiche Kalzium Exposition sind (Miller et al. 2005), die wahrscheinlich Konten für die höheren quantal Inhalt der phasischen Terminals (Msghina et al bedeuten. , 1998, 1999). Daneben wirken sich Unterschiede in der Calcium-bindende Protein frequenin (Jeromin et al., 1999) und Ultrastruktur (King et al., 1996), um die Differenz synaptischen Wirksamkeit (Cooper beitragenet al., 2003).

(.; Cooper et al, 2003. Bradacs et al, 1997) Einige frühere Studien haben die Muskel-Phänotyp der extensor Muskelfasern untersucht. Vergleicht man die Regulierung von Muskel-Differenzierung für rein tonische und phasische Fasertypen in die Krebse auf gemischte Fasertypen, für das Bein extensor dass dumpf innerviert ist wie könnte Hinweise auf Muskel-Phänotyp Expression und Regulation (Laframboise et al, 2000 bereitzustellen;. Sohn et al, 2000;. Griffis et al, 2001;. Mykles et al, 2002)..

Viele grundlegende Fragen bleiben in der Neurobiologie angesprochen werden, und das Präparat kann bei der Bewältigung einige von ihnen zu helfen. Ein paar interessante Themen im Bereich heute bekannt, dass mit dem Bein extensor näherte sein könnte: 1) Bestimmung der zellulären Mechanismen, die synaptische Depression im High-Output-Anschlüsse unterliegen (Ist die Depression durch eine Reduktion der Ca2 +-Eintrag, das Fehlen eines kompetenten leicht lösbare Vesikel (RRV) Pool und / oder Veränderungen der postsynaptischen Empfänglichkeit?) 2) Die Bestimmung der mechanistische Rolle von 5-HT, wenn nach der Induktion der synaptischen Depression zu einer schnelleren Genesung und 3 zu fördern angewendet) Feststellung, ob die Formen der quantal Strömungen, die aus anregenden phasischen Terminals entstehen werden während der Induktion von Depressionen bis hin zu Vor-und postsynaptischen Komponenten synaptische Depression Adresse verändert.

Diese NMJ ist wichtig, laufende Forschung und zukünftige Forscher, weil es uns ermöglicht, wichtige Informationen, dass die Untergebenen Mechanismen der synaptischen Leistung direkt an der Freisetzung Standorten gemessenen Adressen zu erhalten. Aktuelle Forschung in diesem Bereich ist die Bereitstellung von Informationen über die Modulation der synaptischen Depression, die durch 5-HT und die Dynamik der Vesikel-Pools. Solche Themen beziehen sich auf die wesentlichen Grundlagen der synaptischen Übertragung, die für alle neuronalen Systemen.

Materials

Crayfish (Procambarus clarkii). Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA., USA. Standard crayfish saline: Modified from Van Harreveld's solution (1936). (in mM) 205 NaCl; 5.3 KCl; 13.5 CaCl22H2O; 2.45 MgCl26H2O; 5 HEPES and adjusted to pH 7.4 Dissection tools: Fine #5 tweezers, fine scissors, knife blade holder, #26002-20 insect pins (all obtained from Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139) Sylgard coated dissection dish, a recording dish either constructed with suction electrode or use a suction electrode and anther manipulator to hold a suction electrode. Dissecting microscope with zoom function for intracellular recordings. For focal recording on visualized terminals a compound microscope with upright objectives (4 x and 20X) is used. One needs a Hg light source. Standard intracellular amplifier and A/D board for on line recording to a computer. Electrical signals are recorded on line to a PowerLab/4s interface (ADInstruments, Australia). We use standard software from ADInstruments named Chart or Scope. Chemicals: We use a vital fluorescent dye, 4 [4 (diethylamino) styryl] N methylpyridinium iodide (4 Di 2 Asp; Molecular Probes, Eugene, OR), to visualize the varicosities (Marigassi et al., 1987; Cooper et al., 1995a). All saline chemicals were obtained from Sigma chemical company (St. Louis, MO). For intracellular recordings we use glass capillary tubing (catalogue # 30-31-0 from FHC, Brunswick, ME, 04011, USA) and for focal macropatch electrodes we use Kimax-51, Kimble Products Art. No. 34502, ID 0.8-1.1mm, length 100mm. The intracellular electrode should have a resistance of 20 to 30 mOhm. The macropatch electrode is constructed by breaking off the tip of the glass after a fine tip was made from an electrode puller. The broken off tip needs to be a clean perpendicular break about 20μM in diameter. The tip is then heat polished to about 10μM inner diameter. The shaft of the electrode is then run over a heating element to cause it to bend about 45 degrees with a gradual bend. This produces a flat or perpendicular electrode lumen over the nerve terminal as the angle with the micro-manipulator will produce about another 45 degrees to the preparation.