Las grabaciones fisiológicas de NMJs de salida de alta y baja en el músculo extensor de piernas cangrejo de río

Summary

Este artículo demuestra cómo llevar a cabo los registros electrofisiológicos de las respuestas sinápticas en el músculo extensor de la pierna a pie de un cangrejo de río y cómo las terminales nerviosas se visualizan para mostrar las diferencias morfológicas de alto y bajo rendimiento terminales nerviosas.

Abstract

Se explica en detalle cómo exponer y llevar a cabo los registros electrofisiológicos de las respuestas sinápticas de alta (fásico) y baja (tónica) las neuronas motoras que inervan la salida del músculo extensor de la pierna a pie de un cangrejo de río. Claras diferencias están presentes en la fisiología y la morfología de las terminaciones nerviosas fásica y tónica. El axón tónica contiene muchas más mitocondrias, lo que le permite tomar una tinción vital con más intensidad que el axón fásica. Los terminales tienen varices tónico, y la terminal fásica es filiforme. Los terminales de tónica son bajos en la eficacia sináptica, pero muestran dramáticas respuestas facilitadas. Por el contrario, los terminales fásicas son altos en eficacia cuántica, pero muestran la depresión sináptica con la estimulación de alta frecuencia. La salida cuántica se mide con un electrodo de macropatch focal se colocan directamente sobre las terminales nerviosas visualizado. Ambos terminales fásica y tónica inervan las fibras musculares mismo, lo que sugiere que las diferencias inherentes a las neuronas, en vez de retroalimentación diferencial retrógrada de los músculos, dan cuenta de la diferenciación morfológica y fisiológica.

Protocol

1) Introducción

Las neuronas motoras comunicarse con una fibra muscular en las sinapsis que se conocen colectivamente como una unión neuromuscular (UNM). NMJs se puede acceder fácilmente en la mayoría de las preparaciones del músculo del cangrejo de río. Muchos de los cangrejos de río NMJs demostrar la no adición potencial postsináptico excitador (PPSE), similar a las señales eléctricas generadas clasificados en las dendritas postsinápticos en el SNC de los mamíferos o las respuestas debajo del umbral señalado en NMJs vertebrados (Wiersma y Van Harreveld de 1938, Katz & Kuffler, 1946) . El NMJs cangrejos pueden servir como modelos fundamentales sináptica para proporcionar información general en la transmisión sináptica y la diferenciación sináptica.

En general, las unidades de motor regular los aspectos de la conducta animal a través del tipo de comunicación sináptica en NMJs y propiedades de los músculos. Desde la primera observación de "rápido" y contracciones "lento" en el músculo del cangrejo y la langosta más músculo (Lucas, 1907, 1917), similar diferenciación muscular contráctil ha sido descrita en otros tipos de cangrejos de río musculares como los flexores de la abdominal (Kennedy y Takeda, 1965 , b) y extensores de la extremidad (Van Harreveld y Wiersma, 1936). "Fast" contracciones de iniciar una respuesta rápida. Por ejemplo, la tapa la cola del cangrejo de río es un comportamiento rápido. "Slow" contracciones mantener los movimientos lentos y ayudar a mantener la postura (Bradacs et al., 1997). Correspondiente al "rápido" y contracciones "lento" músculo ", fásica / alto rendimiento" y "salida tónico / baja" son ampliamente utilizados para describir las neuronas motoras. La diferencia en la tasa y el tiempo de la contracción muscular se debe en parte a diferencias en la estructura sináptica presináptica y la fuerza sináptica (King et al., 1996). Proteína miofibrilar isoforma expresión también es importante en las diferencias de contracción, pero en los preparativos como la de los músculos extensores de la pierna, en la que está inervado una fibra dada por los dos tipos de neuronas motoras, la atención se centra en las diferencias de las terminales sinápticas, ya que los terminales de compartir la célula diana mismo (Mykles et al., 2002). Un estudio anterior examinó los dos axones excitatorios motor del extensor pierna y describe los fenotipos fásica y tónica (Bradacs et al., 1997). En este informe, muestran cómo realizar la disección y la obtención de grabaciones para que los demás aún puede investigar las propiedades de la diferenciación sináptica de las terminales nerviosas.

Vistos con microscopio electrónico de transmisión, varias series de secciones obtenidas de la tónica y fásica terminales en el músculo extensor cangrejos pierna reveló que los terminales tónico contienen más vesículas PVP de terminales fásica, las mitocondrias son más frecuentes en las neuronas tónica, y las sinapsis en los terminales fásica más complejas que las de las sinapsis de baja producción, ya que contienen varias zonas activas con un espacio variado (Miller et al, 2002; Johnstone et al, 2008;. King et al, 1996;.. Bradacs et al, 1997). Los terminales de salida de baja tónica también son más susceptibles a la transmisión sináptica mejorar con la serotonina neuromodulador (5-HT) que son los terminales fásica (Cooper et al., 2003).

El hecho de que la tónica y fásica MNJ están presentes en la misma fibra muscular hace que sea más fácil de evaluar las diferencias presináptica de una fibra muscular determinado y para abordar las cuestiones de la fatiga muscular, depresión sináptica y la diafonía sináptica. Varias preguntas quedan por abordar en esta preparación, como por ejemplo si hay diferencias en la densidad de los receptores postsinápticos y subtipos de receptores de glutamato postsinápticos en los objetivos de la tónica y fásica terminales, pero una mejor comprensión de las diferencias fundamentales en la anatomía y la fisiología de estos dos unidades de motor ayuda en la construcción de una base de conocimientos más profundos. La esperanza es que los principios fundamentales aprendidos en esta preparación sináptica será aplicable a otras sinapsis en diferentes preparaciones y mejorar las investigaciones futuras en este modelo sináptica de los cangrejos de río.

2) Los métodos

1. Todos los experimentos se llevan a cabo en las piernas el primer o segundo caminar del cangrejo de río de tamaño mediano (Procambarus clarkii). Los animales son alojados individualmente en envases de plástico con agua oxigenada. La temperatura de la habitación de los animales está en el rango de 13 ° C-16 ° C. Los animales son alimentados con comida de pescado seco y el agua cambia una vez por semana.

   
   Figura 1: Esquema de una pierna cangrejos de río a pie y los seis segmentos distales.

2. La porción distal de la pierna caminando en un cangrejo de río es anatómicamente dividido en seis segmentos (Figura 1). El extensor de la pierna se encuentra en el meropodite, y el conjunto de nervios que se está aislada cerca de la articulación meropodite ischiopodite. El axón tónica o fásica puede be selectiva estimulado, según sea necesario para fines fisiológicos después de estar expuestos.
3. Cooper y Cooper (2009) describe algunos aspectos de la disección inicial, incluyendo los métodos para exponer la Excitor de la neurona motora primer partido dentro de la región meropodite, pero su descripción no proporciona los cuidados necesarios para proteger el músculo extensor de los daños, como lo fue no es necesario para hacer frente a la preparación muscular abridor. Con el fin de proteger a los extensores de la pierna caminando primera o la segunda se elimina de los cangrejos de río, que mide 10.6 cm de longitud corporal (Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA), mediante la inducción de los animales para automatizar la extremidad con pellizco con fuerza distal al plano de fractura en el segmento de ischiopodite. La pierna se coloca en el plato con la disección lateral (lado exterior) de cara al espectador. El partido de ida se dio la vuelta hasta que el espectador puede estar seguro de la parte externa (lateral) hacia arriba en la placa de la disección, por lo general con la parte arqueada hacia arriba (Figura 2). Colocar la pierna en un pedazo de papel de seda hace que sea más fácil girar la preparación al hacer estos cortes.

   
   Figura 2: La parte lateral de la meropodite, por lo general el lado que se arquea, se dirige hacia arriba en la placa de disección ..

4. Con un interruptor de hoja de bisturí y tenedor, una hoja de afeitar afilada se utiliza para grabar la cutícula hasta que estén atravesando en el modelo que se muestra en la Figura 3 para el segmento de meropodite. Hay que tener cuidado de no cortar demasiado distal en el dorso ventral para cortar por la articulación meropodite-carpopodite.

   
   Figura 3: El segmento de meropodite con las líneas de un arquetipo de texto para el grabado de la ventana de la cutícula.

   La preparación se coloca en solución salina. El plato debe tener una disección Sylgard (Dow Corning) revestimiento en la parte inferior (1 cm de grosor). El Sylgard se utiliza de modo que los pasadores de insectos pueden ser atrapados en él para la celebración de la preparación todavía. En este punto, un alfiler se ha quedado atascado en el medio del segmento carpopodite y en la cara dorsal del segmento ischiopodite (Figura 4). Preparados disecados se bañan en una solución salina estándar de cangrejos de río, modificado a partir de solución de Van Harreveld s (1936), que se hace con 205 NaCl; 5.3KCl; 13,5 _CaCl2, 2H ₂ O, 2,45 de MgCl _2, 6H ₂ O, 5 HEPES y se ajusta a pH 7,4 (en mm).

   
   Figura 4: El segmento de meropodite con la ventana de corte siendo levantado. Anote la ubicación de los pasadores de la disección.

5. La cutícula se levanta suavemente en la región distal y las fibras musculares se cortan lejos de la cutícula, haciendo movimientos hacia la base de la pierna. La cutícula se puede quitar.
6. El apodema (tendón) se corta en la articulación meropodite-carpopodite. Un perno se coloca en la superficie interna del tendón flexor de mostrar que el corte se debe hacer (Figura 5). El tendón se luego se pellizcó en el que se cortó con unas pinzas y el músculo flexor arrancó levantando en dirección caudal (Figura 6), dejando al descubierto el nervio principal de la pierna y el músculo extensor.

   
   Figura 5: El apodema del músculo flexor se destaca por el desplazamiento desde el flexor con un alfiler.

   
   Figura 6: El apodema del músculo flexor se corta y se retira con cuidado para no dañar el nervio principal de la pierna.

7. El nervio principal de la pierna se corta en la articulación meropodite-carpopodite y cuidadosamente hacia atrás sobre el músculo extensor. La superficie medial del músculo se utiliza en este estudio. La separación de los nervios a los músculos extensores de la pierna el nervio principal se puede mejorar, tirando suavemente el muñón distal del nervio principal pierna a un lado de la preparación. Al pelar el nervio principal de la pierna de nuevo sobre el músculo extensor, pequeñas ramas del axón puede ser necesario cortar. Estas son las ramas de las neuronas motoras inhibitorias del músculo extensor. El paquete más grande ramificación del nervio pierna principal, cerca del extremo proximal de la meropodite es el conjunto de nervios pequeños de interés.

   
   Figura 7: El nervio principal de la pierna se corta y se retiró en dirección proximal.

   Este conjunto de nervios que se puede ver con la tinción de azul de metileno (Figura 8) o con 4-Di-2-ASP tinción fluorescente (Figura 9).

   
   Figura 8: El músculo extensor manchada con azul de metileno. Tenga en cuenta las ramificaciones del axón y lados axones fácilmente visibles en el nervio. Flechas rojas demarcar la pista de los nervios.

   
   Figura 9: Los axones de las manchas del nervio motor de 4-Di-2-ASP. El axón tónica es más brillante visible debido a la mayor contenido mitocondrial.

   
   Figura 10A: terminales de las neuronas individuales fásica y tónica teñidas con 4-Di-2-ASP. Tenga en cuenta las varices en las terminales de tónica y la naturaleza fina de los terminales fásica.

   
   Figura 10B-Tonic señaló

   
   Figura 10C-fásica señaló

3) perfiles fisiológicos

1. Para observar el potencial postsináptico excitador (PPSE) de las neuronas tónica o fásica, uno de los axones aislados en el conjunto de nervios que es estimulado por un electrodo de succión (Figura 11) conectado a un estimulador Grass, mientras que el potencial intracelular en el músculo son monitoreados (Johnstone et al., 2008). La estimulación a 70 Hz se aplica a la tónica del axón con el fin de promover una respuesta facilitada por el NMJs bajo rendimiento, o un solo pulso (1 Hz) se aplica a los axones fásica con el fin de obtener grandes PPSE de la salida de alta NMJs como se muestra en la Figura 12. El PPSE se registran en una computadora a través de una interfaz PowerLab/4s.

   
   Figura 11: electrodo de estimulación se coloca sobre un solo axón en el conjunto de nervios. Tenga en cuenta la línea verde sobre los dos principales axones.

   
   Figura 12: los potenciales postsinápticos (EPSPS) de las neuronas o tónico fásica como las obtenidas por registros intracelulares.

2. Investigación en la naturaleza de facilitación sináptica y la depresión sináptica puede ser abordado por varios paradigmas experimentales con el NMJs de salida de alta y baja. La facilitación de la NMJs baja producción depende de la frecuencia, como se muestra para los pulsos de 20, 40 y 60 Hz de aproximadamente 20 estímulos (Figura 13).

   
   Figura 13: PPSE en respuesta a un tren de pulsos de estimulación dado con tres frecuencias diferentes de 20, 40 y 60 Hz en solución salina normal, cangrejos de río.

3. La tasa de depresión sináptica a la frecuencia de estimulación se relaciona también con la NMJs de alto rendimiento. La figura 14 muestra un continuo de 5 Hz de estimulación presionando la UNM más de 30 min. Con mayor frecuencia de estimulación, la preparación se deprimen con mayor rapidez (Bradacs et al., 1997).

   
   Figura 14: Amplitud de EPSP de la respuesta fásica durante 5 Hz estimulación para inducir a la depresión.

4) Las respuestas cuántica

1. Un procedimiento similar al descrito para el músculo del primer partido de los cangrejos de río (Cooper y Cooper, 2009) se utiliza en esta preparación. El PPSE cuántico directamente sobre las regiones de identificación de las terminales nerviosas se registran mediante la colocación de la luz de un electrodo de grabación de la macro-parche en varices sináptica visualiza con el colorante vital 4-Di-2-Asp (5 M, 5 min de tratamiento, Cooper et al, 1995;. Magrassi et al, 1987).. El espontáneo, así como las respuestas evocadas cuántica se puede grabar a lo largo de las terminaciones nerviosas. El evocada y espontánea potenciales sinápticos se registran con el electrodo de macro-parche (Dudel, 1981; Wojtowicz et al, 1991;. Mallart, 1993). Kimax de vidrio (diámetro exterior: 1,5 mm) fue detenido y pulido al fuego para producir puntas de parche con un diámetro interior de 10 a 20 micras (Figura 15).

   
   Figura 15: La luz de un electrodo de grabación de la macro-parche ..

   La luz del electrodo se llena con el medio baño. El amplificador es el mismo que el utilizado para las grabaciones intracelular antes mencionados. Electrodo y la resistencia del sello puede ser determinada por los impulsos de prueba que pasa corriente a través del electrodo. En nuestros experimentos, las resistencias de cierre varió desde 0,3 hasta 1,0 MOhm y la resistencia del electrodo varió desde 0,5 hasta 1,0 MOhm. Resistencia del sello pueden ser monitoreados a lo largo de la grabación.

2. Recuento directo de eventos cuantal es posible con frecuencias baja estimulación. Para cada respuesta evocada, el número de eventos cuánticos pueden ser fácilmente determinadas por los terminales de salida bajo (Figure 16). Estos conteos directos pueden ayudar a estimar el contenido medio cuántica (Del Castillo y Katz, 1954;. Cooper et al, 1995). Desde el NMJs evocados de alto rendimiento producen varios acontecimientos evocados cuántica, la amplitud media o la zona de las deflexiones, junto con la amplitud de pico o área promedio de los eventos espontáneos, se puede utilizar para aproximar el contenido medio cuántica (Cooper et al. , 1995).

   
   Figura 16 rastros registrados focal de un fásica y tónica MNJ.

   
   Figura 17

Discussion

Hemos demostrado en este informe la manera de analizar, registrar y cuantificar las respuestas sinápticas en una preparación de cangrejo de río único neuromuscular en la que dos terminales de alta y baja producción-inervan la misma fibra muscular. Los preparativos neuromuscular en el cangrejo de río ofrecen muchas ventajas sobre los vertebrados uniones neuromusculares, ya que sólo unas pocas neuronas motoras excitatorias son necesarios para inervar el músculo, y desde las neuronas son identificables desde la preparación hasta la preparación (Atwood, 1976). Además, el neurotransmisor excitatorio es el glutamato, y el potencial postsináptico excitador (PPSE) se clasifican, por lo que las propiedades biofísicas de los hechos calificados son análogas a las dendritas de las neuronas en el SNC de los vertebrados. Las corrientes cuántica, sin embargo, se puede controlar directamente en los sitios postsinápticos (Cooper et al., 1995).

5 Hz estimulación repetitiva del nervio fásica da lugar a grandes PPSE que se convierten en muy deprimido después de varios minutos. Este tipo de depresión es común en los artrópodos fásica las uniones neuromusculares (Atwood y Cooper, 1996). La presencia de los terminales tónico junto a los terminales fásico permite evaluar si el objetivo postsináptica es modificado en gran medida durante y después de la depresión de las neuronas motoras fásicas. Además, los terminales de salida de baja proporcionar una preparación buena para investigar los mecanismos que subyacen a la facilitación sináptica (Desai-Shah et al, 2008;. Desai-Shah y Cooper, 2009)

Los terminales de salida de alta proporcionan un campo de juegos para investigar la modulación de la tasa de depresión sináptica y el proceso de recuperación. Preparaciones accesible y viable debe ayudar a descifrar los mecanismos detrás de la depresión sináptica. En esta preparación cangrejos extensor en las piernas, la aplicación exógena de la serotonina es otra herramienta para investigar la recuperación de la depresión sináptica y, potencialmente, un medio de fomentar la investigación en la movilización de grupos de vesículas sinápticas. Esta preparación proporciona varias ventajas experimentales, ya que las fibras musculares individuales están inervadas por neuronas motoras, tanto fásica y tónica.

Dado que la serotonina aumenta el número de vesículas que se liberan con el estímulo provocado, y puesto que favorece la recuperación durante la depresión, es evidente que hay una cierta modulación de las piscinas de la vesícula para aumentar la probabilidad de que la fusión con la presencia de la serotonina (Johnstone et al., 2008 ; Logsdon et al, 2006;. Sparks et al, 2004).. Modelos que explican la dinámica de los grupos de vesículas dentro de la terminal nerviosa presináptica durante la estimulación de baja frecuencia, en oposición a un estado de depresión, también tienen que ser considerados entre los distintos protocolos experimentales que son posibles con esta preparación.

Se ha observado en otros sistemas que alrededor del 30% del fondo de la vesícula se somete a un reciclaje rápido, mientras que el resto de las vesículas reciclada a través de un camino lento de reciclaje tradicionales a través del retículo endoplásmico (Harata et al, 2001;. Tsien et al. , 2001). Como caminos de doble también puede estar presente en este sistema. Si se carece de ATP en el estado depresivo de la terminal presináptica, luego de atraque y desatraque, no podría ser capaz de producir, por lo que muchas vesículas más descargado que permanecen en la superficie sináptica. Desde hace más vesículas se libera rápidamente cuando los terminales están expuestos a 5-HT, es factible que más están contenidas dentro de la piscina fácilmente liberable (RRV). Sin embargo, en el estado de depresión, con una reducción de la ATP, el acoplamiento y desacoplamiento puede ser bloqueado, incluso en presencia de 5-HT, que a su vez deja vesículas descargan en la superficie sináptica. Dado que los datos preliminares sugieren que más vesículas se liberan en el tiempo con la exposición prolongada 5 HT y la estimulación, la distribución de la piscina de la vesícula de los caminos de reciclaje rápido y lento puede ser sesgada a tener vesículas para un nuevo lanzamiento (de Johnstone et al. , 2008; reseñas-Desai-Shah et al, 2008;. Desai-Shah y Cooper, 2009)

Con las técnicas de las grabaciones macropatch focal de las corrientes postsinápticas y las medidas de los cuantos de una sola de las regiones definidas de la terminal del nervio motor, uno puede hacer preguntas para determinar si la depresión sináptica se está produciendo como consecuencia del menor número de vesículas de ser liberado o por alteraciones de la función de los receptores postsinápticos. Se ha demostrado que las vesículas son más sensibles a la fusión en la UNM fásico de esta preparación para una exposición de calcio equivalente (Miller et al. 2005), lo que explica probablemente por el mayor contenido medio cuántica de los terminales fásica (Msghina et al. , 1998, 1999). Además, las diferencias en el frequenin calcio de unión a proteínas (Jeromin et al., 1999) y la ultraestructura (King et al., 1996) contribuye a la eficacia sináptica diferencial (Cooperet al., 2003).

Algunos estudios previos han explorado el fenotipo muscular de las fibras de los músculos extensores (Bradacs et al, 1997;. Cooper et al, 2003).. Al comparar la regulación de la diferenciación muscular de los tipos de fibras puramente tónica y fásica en el cangrejo de río para los tipos de fibras mixtas, al igual que para el extensor pierna que está debidamente inervadas, podría proporcionar pistas sobre la expresión muscular fenotipo y la regulación (LaFramboise et al, 2000;. Sohn et al, 2000;. Griffis et al, 2001;. Mykles et al, 2002)..

Muchas de las preguntas fundamentales quedan por resolver en la neurobiología, y esta preparación puede ayudar a hacer frente a algunos de ellos. Algunos temas de interés en el campo hoy en día que pueden ser abordados con el extensor en la pierna son: 1) Determinar los mecanismos celulares que subyacen a la depresión sináptica de alta terminales de salida (es la depresión debido a la reducción de Ca2 + de entrada, la falta de una autoridad competente fácilmente liberable de vesículas (RRV) de tenis, y / o post-sináptica alterada receptividad?) 2) Determinar la función mecánica de 5-HT cuando se aplica después de la inducción de la depresión sináptica para promover una recuperación más rápida, y 3) Determinar si las formas de la cuántica corrientes que surgen de la estimulación de las terminales fásica se alteran durante la inducción de la depresión a la dirección de los componentes pre-y post-sináptica de la depresión sináptica.

Este MNJ es importante para la investigación en curso y futuros investigadores, ya que nos permite obtener la información pertinente que se ocupa de los mecanismos de subalterno de rendimiento sináptica medido directamente en los sitios de liberación. La investigación actual en esta área es proporcionar información sobre la modulación de la depresión sináptica de 5-HT y la dinámica de las piscinas de la vesícula. Dichos temas se refieren a los fundamentos básicos de la transmisión sináptica relevante para todos los sistemas neuronales.

Materials

Crayfish (Procambarus clarkii). Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA., USA. Standard crayfish saline: Modified from Van Harreveld's solution (1936). (in mM) 205 NaCl; 5.3 KCl; 13.5 CaCl22H2O; 2.45 MgCl26H2O; 5 HEPES and adjusted to pH 7.4 Dissection tools: Fine #5 tweezers, fine scissors, knife blade holder, #26002-20 insect pins (all obtained from Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139) Sylgard coated dissection dish, a recording dish either constructed with suction electrode or use a suction electrode and anther manipulator to hold a suction electrode. Dissecting microscope with zoom function for intracellular recordings. For focal recording on visualized terminals a compound microscope with upright objectives (4 x and 20X) is used. One needs a Hg light source. Standard intracellular amplifier and A/D board for on line recording to a computer. Electrical signals are recorded on line to a PowerLab/4s interface (ADInstruments, Australia). We use standard software from ADInstruments named Chart or Scope. Chemicals: We use a vital fluorescent dye, 4 [4 (diethylamino) styryl] N methylpyridinium iodide (4 Di 2 Asp; Molecular Probes, Eugene, OR), to visualize the varicosities (Marigassi et al., 1987; Cooper et al., 1995a). All saline chemicals were obtained from Sigma chemical company (St. Louis, MO). For intracellular recordings we use glass capillary tubing (catalogue # 30-31-0 from FHC, Brunswick, ME, 04011, USA) and for focal macropatch electrodes we use Kimax-51, Kimble Products Art. No. 34502, ID 0.8-1.1mm, length 100mm. The intracellular electrode should have a resistance of 20 to 30 mOhm. The macropatch electrode is constructed by breaking off the tip of the glass after a fine tip was made from an electrode puller. The broken off tip needs to be a clean perpendicular break about 20μM in diameter. The tip is then heat polished to about 10μM inner diameter. The shaft of the electrode is then run over a heating element to cause it to bend about 45 degrees with a gradual bend. This produces a flat or perpendicular electrode lumen over the nerve terminal as the angle with the micro-manipulator will produce about another 45 degrees to the preparation.