הקלטות פיזיולוגיים של NMJs פלט גבוה ונמוך על שרירים ברגליים סרטן הנהרות extensor

Summary

מאמר זה מדגים כיצד לנהל הקלטות אלקטרו התגובות הסינפטי על השרירים extensor ברגל הליכה של סרטן וכיצד מסופי העצב הם דמיינו כדי להראות את ההבדלים המורפולוגיים ברוטו גבוהה ונמוכה פלט מסופים עצב.

Abstract

אנחנו מסבירים בפירוט כיצד לחשוף לנהל הקלטות אלקטרו התגובות הסינפטי גבוה (phasic) נמוך (טוניק) מנוע נוירונים פלט innervating השרירים extensor ברגל הליכה של סרטן נחלים. הבדלים ברורים נמצאים הפיזיולוגיה והמורפולוגיה של מסופי העצב phasic טוניק. האקסון טוניק מכיל מיטוכונדריה רבים יותר, המאפשרים לה לקחת חיוני כתם בעוצמה רבה יותר מאשר האקסון phasic. מסופי טוניק יש ורידים, ואת הטרמינל phasic הוא filiform. מסופי טוניק נמוכים היעילות הסינפטית אבל להראות תגובות הקל דרמטי. לעומת זאת, מסופי phasic גבוהות של יעילות quantal אלא להראות דיכאון סינפטיים עם גירוי בתדירות גבוהה. התפוקה נמדדת quantal עם אלקטרודה macropatch המוקד ממוקם ישירות על מסופי העצב דמיינו. שני מסופי phasic טוניק innervate סיבי השריר זהה, אשר טוען כי הבדלים הטבועים נוירונים, ולא משוב ההפרש מדרדר מן השריר, להסביר ההבחנה מורפולוגיים ופיזיולוגיים.

Protocol

1) מבוא

עצב מוטורי לתקשר עם סיב שריר ב סינפסות אשר יכונו צומת neuromuscular (NMJ). NMJs ניתן לגשת בקלות בהכנות שריר ביותר סרטנים. רבים NMJs סרטנים להוכיח שאינם spiking postsynaptic פוטנציאלים מעוררים (EPSP) דומה את האותות החשמליים מדורגים שנוצר דנדריטים postsynaptic בתוך מערכת העצבים המרכזית יונקים או התגובות התת ציין NMJs חוליות (Wiersma & Van Harreveld, 1938; כץ & Kuffler, 1946) . NMJs סרטנים יכולים לשמש מודלים הסינפטי הבסיסית לספק תובנות כלליות לתוך בשידור סינפטי והבחנה הסינפטי.

באופן כללי, יחידות מוטוריות להסדיר היבטים של התנהגות בעלי חיים באמצעות סוג של תקשורת סינפטית ב NMJs ומאפיינים של השרירים. מאז התצפית הראשונה של "מהיר" התכווצויות "איטי" שריר סרטנים סרטנים שריר מקרוב (לוקאס, 1907, 1917), התכווצות שרירים הבחנה דומה תוארה שריר סוגי סרטנים אחרים כגון מכופפי בטן (קנדי & טאקדה, 1965a , ב) ו פושטי איבר (ואן Harreveld & Wiersma, 1936). "מהיר" התכווצויות ליזום מענה מהיר. לדוגמה, להעיף זנב סרטנים היא התנהגות מהר. "איטי" התכווצויות לשמור על תנועות איטיות לסייע בשמירה על היציבה (Bradacs et al. 1997). מקבילים על "מהיר" התכווצויות "איטי" שרירים ", phasic / פלט גבוה" ו "פלט טוניק / נמוך" משמשים באופן נרחב כדי לתאר את הנוירונים המנוע. ההבדל בשיעור והעיתוי של התכווצות שרירים היא בחלקה הקשורים presynaptic הבדלים במבנה הסינפטי וכוח הסינפטי (King et al. 1996). Myofibrillar איזופורם ביטוי החלבון חשוב גם הבדלים התכווצות, אך ההכנות כמו זה של שריר פושטי רגל, שבו הוא נתון סיב מעוצבבים על ידי שני סוגים של נוירונים מוטוריים, הדגש הוא על הבדלים סינפטיים של המסופים, מאז מסופי המניות תא היעד זהה (Mykles et al., 2002). מחקר מוקדם יותר בדק את שני האקסונים מנוע הגירוי של פושטי הרגל ותיאר את פנוטיפים phasic טוניק (Bradacs et al. 1997). בדו"ח זה, אנו מדגימים כיצד לבצע את הנתיחה ולקבל הקלטות כדי שאחרים יוכלו להמשיך לחקור את המאפיינים של בידול הסינפטי אלה מסופי העצב.

נצפה עם במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים, סדרות שונות של חלקים המתקבלים טוניק ומסופי phasic על שריר הרגל סרטנים extensor גילה כי מסופי טוניק להכיל יותר מאשר שלפוחית ​​RRP מסופי phasic; המיטוכונדריה הם שכיחה יותר נוירונים טוניק, ואת סינפסות על מסופי phasic הם מורכבות יותר מאשר אלו על סינפסות, תפוקה נמוכה, שכן הם מכילים מספר רב של אזורי פעילות מגוונת עם המרווח (Miller et al, 2002; ג'ונסטון et al, 2008;. King et al, 1996;.. Bradacs et al, 1997). נמוך פלט טוניק מסופי הם גם רגישים יותר בשידור סינפטי שיפור עם neuromodulator סרוטונין (5-HT) מאשר הם מסופי phasic (Cooper et al., 2003).

העובדה טוניק ו NMJ phasic נמצאים על סיבי השריר באותו מקל כדי להעריך את ההבדלים presynaptic על סיבי שריר נתון במטרה לענות על שאלות של עייפות שרירים, דיכאון הסינפטי ולדבר לחצות הסינפטי. שאלות שונים להישאר לטפל בהכנה זו, כגון אם יש הבדלים בצפיפות הקולטן postsynaptic ואת קולטני גלוטמט תת מטרות postsynaptic עבור טוניק ומסופי phasic, אלא הבנה טובה יותר של הבדלים בסיסיים באנטומיה ופיזיולוגיה של אלה שתי יחידות מוטוריות יסייע בבניית בסיס ידע עמוק יותר. התקווה היא כי עקרונות היסוד למדו לקראת זה הסינפטי יחולו סינפסות אחרות בהכנות שונים ישפר חקירות בעתיד במודל זה סינפטיים של סרטנים.

2) שיטות

1. כל הניסויים נערכים על הרגליים בהליכה הראשון או השני של סרטנים בינוניים (Procambarus כלארקיי). החיות הם שוכנו בנפרד במכלי פלסטיק עם מים מחומצן. טמפרטורת החדר היא חיה בטווח של 13 ° C-16 ° C. בעלי החיים ניזונים עם מזון דגים יבש המים השתנו על בסיס שבועי.
   
   
   איור 1: סכמטי של רגל סרטנים הליכה שישה קטעים דיסטלי.
2. ההיבט דיסטלי של הרגל הליכה סרטנים מחולק מבחינה אנטומית לתוך שישה מקטעים (איור 1). פושטי הרגל ממוקם meropodite, ואת פקעת עצבים כי יהיה מבודד הוא קרוב ischiopodite meropodite משותף. האקסון טוניק או phasic יכול להיות מגורה באופן סלקטיבי כמו needed לצרכים פיזיולוגיים לאחר שהם נחשפים.
3. קופר וקופר (2009) תיאר כמה היבטים של הניתוח הראשוני, כולל שיטות חשיפת מעורר של הנוירון המוטורי פותחן בתוך האזור meropodite, אבל התיאור שלהם אינו מספק את הטיפול הנדרש להגנה על השרירים extensor מפני נזקים, כפי שהיה לא צריך להתייחס הכנה שריר פותחן. על מנת להגן על extensor, הליכה ברגל הראשון או השני יוסר סרטנים, מדידה 6-10 ס"מ אורך הגוף (Atchafalaya ביולוגית אספקת ושות, Raceland, לוס אנג'לס), על ידי גרימת את בעל החיים automize האיבר עם צביטה חזקה דיסטלי למישור השבר במגזר ischiopodite. הרגל מונחת על הצלחת דיסקציה עם לרוחב (הצד החיצוני) מול הצופה. הרגל הוא הסתובב עד שהצופה יכול להיות בטוח החיצון (צד לרוחב) הוא פונה כלפי מעלה על הצלחת הניתוח, בדרך כלל עם הצד קשתי כלפי מעלה (איור 2). הנחת רגל על ​​פיסת נייר, קל יותר להפוך את ההכנה תוך ביצוע קיצוצים אלה.
   
   
   איור 2: הצד הלטרלי של meropodite, בדרך כלל הצד אשר מקושת, הוא פונה כלפי מעלה על הצלחת הניתוח.
4. עם מפסק להב בעל אזמל, סכין גילוח חד משמש לציפורן לחרוט עד עתה חיתוך דרך בדפוס שמוצג באיור 3 עבור מגזר meropodite. הטיפול נלקח לא לחתוך יותר מדי רחוק דיסטלי על הגב כדי לחתוך הגחון על ידי המפרק meropodite-carpopodite.
   
   
   איור 3: קטע meropodite עם קווים כתבנית הציע תחריט מחלון לציפורן.
   
   
   הכנה ממוקם מלוחים. המנה לנתיחה צריך ציפוי (Dow Corning) Sylgard בתחתית (1cm עבה). Sylgard משמש כך סיכות החרק יכול להיות תקועה בו לקיום הכנה עדיין. בשלב זה, סיכה תקוע באמצע קטע carpopodite ו בהיבט הגבי של המגזר ischiopodite (איור 4). ההכנות גזור שטופים מלוחים סרטנים רגיל, שונה מן הפתרון של ואן Harreveld (1936), אשר הוא עשה עם 205 NaCl; 5.3KCl; 13.5 CaCl _2: 2H ₂ O, 2.45 MgCl _2: 6 שעות ₂ O; 5 HEPES והותאמו pH 7.4 (מ"מ).
   
   
   
   איור 4: קטע meropodite עם חלון לחתוך להיות המריא. שים לב למיקום של סיכות לנתיחה.
5. לציפורן היא הרימה בעדינות באזור דיסטלי ואת סיבי השריר מנותקים לציפורן על ידי ביצוע משיכות לעבר בסיס של הרגל. לציפורן ניתן המריא.
6. Apodeme (גיד) הוא חתך במפרק meropodite-carpopodite. סיכה מושם על המשטח הפנימי של גיד מכופף כדי להראות היכן לחתוך את תיעשה (איור 5). גיד הוא צבט אז איפה זה היה לחתוך עם פינצטה את השריר מכופף הוריד ידי הרמתה לכיוון הזנב (איור 6), חשיפת עצבים רגל הראשי השרירים פושטי.
   
   
   איור 5: apodeme של שריר מכופף מסומן על ידי לעקירתם אותו מכופף עם סיכה.
   
   
   
   איור 6: apodeme של שריר מכופף היא לחתוך ולהסיר בזהירות שלא לגרום נזק עצבי ברגל הראשי.
7. עצב הרגל העיקרית היא לחתוך במפרק meropodite-carpopodite ומשך בזהירות לאחור על השריר extensor. המשטח המדיאלי של השריר משמש לאורך כל תקופת המחקר הזה. ההפרדה של העצב לשריר פושטי רגל מן העצב העיקרי ניתן לשפר על ידי משיכתו בעדינות את הגדם דיסטלי של העצב רגל הראשי לצד ההכנה. כאשר קילוף העצב הרגל העיקרי חזרה מעל השריר extensor, ענפים קטנים של האקסון ייתכן שיהיה צורך לחתוך. אלה הם ענפים מן הנוירון המוטורי מעכבות לשריר extensor. צרור גדול מסתעפת מן העצב הרגל העיקרי לקראת סוף הפרוקסימלי של meropodite הוא צרור עצבים קטנה של עניין.
   
   
   איור 7: העצב הרגל העיקרי הוא לגזור לאחור לכיוון פרוקסימלי.
   
   
   חבילה זו ניתן לראות את העצב עם מכתים מתילן כחול (איור 8) או עם 4-Di-2-ASP פלורסנט כתם (איור 9).
   
   
   
   איור 8: מוכתמים שרירים פושטי עם מתילן כחול. הערה ההסתעפות האקסון ושני אקסונים לעין בקלות בתוך העצב. החיצים האדומים demark המסלול העצבי.
   
   
   
   איור 9: אקסונים של מוכתם העצב המוטורי עם 4-Di-2-ASP. האקסון טוניק הוא יותר נראה בהיר בגלל התוכן המיטוכונדריה מוגברת.
   
   
   איור 10A: מסופי בודדת של נוירונים phasic טוניק מוכתם 4-Di-2-ASP. שים לב ורידים על מסופי טוניק ואת אופי דקה של מסופי phasic.
   
   
   
   איור 10 ב-טוניק ציין
   
   
   
   איור 10C-Phasic ציין

3) פיזיולוגיים פרופילים

1. כדי לבחון את הפוטנציאל postsynaptic מעוררים (EPSPs) של הנוירונים טוניק או phasic, אחד אקסונים מבודד צרור העצבים מגורה על ידי אלקטרודה יניקה (איור 11) מחובר ממריץ הדשא בעוד הפוטנציאלים תאיים בשריר מנוטרים (ג'ונסטון et al. 2008). גירוי ב 70 הרץ מוחל על האקסון טוניק על מנת לקדם מענה הקלו על NMJs תפוקה נמוכה, או דופק אחד (1 הרץ) מוחל על האקסון phasic כדי להשיג EPSPs גדול מהתפוקה הגבוהה NMJs כפי שמוצג באיור 12. EPSPs נרשמות למחשב באמצעות ממשק PowerLab/4s.
   
   
   איור 11: אלקטרודה מגרה הניח על האקסון יחיד בתוך צרור העצבים. הערה הקו הירוק מתאר את 2 אקסונים הראשי.
   
   
   
   איור 12: פוטנציאל Postsynaptic (EPSPs) של הנוירונים טוניק או phasic כפי שמתקבלות על ידי הקלטות תאיים.
2. חקירת אופי של סיוע הסינפטי ודיכאון הסינפטי ניתן לגשת באמצעות פרדיגמות שונות ניסיוני עם NMJs פלט נמוך וגבוה. סיוע של NMJs תפוקה נמוכה תלוי בתדירות, כפי שמוצג על פולסים 20, 40 ו - 60 הרץ של כ 20 גירויים (איור 13).
   
   
   איור 13: EPSPs בתגובה רכבת פולסים של גירוי נתון בשלושה תדרים שונים 20, 40 ו - 60 הרץ ב סרטנים מלח רגיל.
3. שיעור הדיכאון הסינפטי לתדר הגירוי קשורה גם NMJs תפוקה גבוהה. איור 14 מראה הרץ רציף 5 של גירוי מדכא NMJ מעל 30 דקות. עם תדירות גירוי גבוה, כהכנה יהיה לדכא במהירות רבה יותר (Bradacs et al. 1997).
   
   
   איור 14: משרעת EPSP התגובה phasic במהלך גירוי 5 הרץ לגרום לדיכאון.

4) תגובות Quantal

1. הליך דומה לזה שתואר על השריר פותחן של סרטנים (קופר קופר, 2009) משמש כהכנה זה. EPSPs quantal ישירות על אזורים זיהוי של המסוף עצב נרשמות על ידי הנחת לומן של האלקטרודה המאקרו תיקון הקלטה על ורידים הסינפטי דמיינו עם צבע החיוני 4-Di-2-ASP (5 מיקרומטר, 5 דק 'טיפול, קופר et al, 1995;. Magrassi et al, 1987).. ספונטני, כמו גם התגובות quantal עורר ניתן להקליט לאורך מסופי העצב. עורר פוטנציאל הסינפטי ספונטנית נרשמות עם אלקטרודה המאקרו התיקון (דוד 'ל, 1981; Wojtowicz et al, 1991;. Mallart, 1993). Kimax זכוכית (קוטר חיצוני: 1.5 מ"מ) היה משך אש מלוטש לייצר טיפים תיקון בקטרים ​​הנעים בתוך 10-20 מיקרומטר (איור 15).
   
   
   איור 15: לומן של האלקטרודה המאקרו תיקון ההקלטה.
   
   
   לומן של האלקטרודה מלא המדיום ים. מגבר הוא זהה לזה המשמש את ההקלטות תאיים שהוזכרו לעיל. אלקטרודה והתנגדות חותם ניתן לקבוע על ידי העברת פולסים המבחן הנוכחי דרך האלקטרודה. בניסויים שלנו, התנגדויות חותם נע בין 0.3 ל 1.0 MOhm ואת התנגדות אלקטרודה נע בין 0.5 ל 1.0 MOhm. התנגדות חותם ניתן לנטר ברחבי ההקלטה.
2. ספירה ישירה של אירועים quantal אפשרי עם תדרי גירוי נמוך. עבור כל תשובה עורר, במספר האירועים quantal ניתן לקבוע בקלות את מסופי תפוקה נמוכה (איור 16). אלה סעיפים ישיר יכול לעזור להעריך את תוכן quantal אומר (דל קסטילו & Katz, 1954;. Cooper et al, 1995). מאז NMJs עורר תפוקה גבוהה לייצר רב quantal אירועים עורר, את המשרעת אזור מתכוון או של סטיות, יחד עם משרעת באזור השיא הממוצע או האירועים ספונטנית, יכול לשמש כדי approximate התוכן quantal אומר (Cooper et al. 1995).
   
   
   איור 16 עקבות מיקוד רשמה phasic ו NMJ טוניק.
   
   
   איור 17

Discussion

אנחנו הוכיחו בדוח זה איך לנתח, לתעד ולכמת התגובות הסינפטי כהכנה סרטנים ייחודיים neuromuscular שבה מסופי שניהם גבוהה ונמוכה פלט innervate את סיב השריר אותו. ההכנות neuromuscular ב סרטנים מציעים יתרונות רבים על פני צמתים חוליות neuromuscular, שכן רק מעט נוירונים מנוע מעוררות יש צורך innervate שריר, ומאז הנוירונים ניתנים לזיהוי מתוך הכנה הכנה (אטווד, 1976). בנוסף, הנוירוטרנסמיטר גלוטמט הוא מעורר, ואת הפוטנציאלים postsynaptic מעורר (EPSP) מדורגות, ולכן מאפייני biophysical של אירועים הם מדורגים מקביל הדנדריטים של נוירונים בתוך מערכת העצבים המרכזית של בעלי חוליות. זרמי quantal, לעומת זאת, ניתן לנטר ישירות באתרי postsynaptic (Cooper et al. 1995).

גירויים חוזרים ונשנים 5 הרץ של העצב phasic מעורר EPSPs גדול להיות מדוכא מאוד לאחר מספר דקות. סוג זה של דיכאון נפוץ arthropod phasic neuromuscular צמתים (אטווד קופר, 1996). הנוכחות של מסופי טוניק לצד מסופי phasic מאפשרת להעריך האם או לא היעד postsynaptic הוא שונה מאוד במהלך ואחרי דיכאון של הנוירון המוטורי phasic. בנוסף, מסופי תפוקה נמוכה לספק הכנה נחמד לחקור המנגנונים העומדים בבסיס הנחיית הסינפטי (דסאי, השאה et al, 2008;. דסאי, השאה קופר, 2009)

מסופי תפוקה גבוהה מספקים קרקע לשחק לחקור אפנון בשיעור של דיכאון הסינפטי ועל תהליך ההחלמה. ההכנות נגיש ובר קיימא אמור לעזור בפענוח המנגנונים מאחורי דיכאון הסינפטי. בכך הכנה רגל סרטנים extensor, יישום אקסוגני של סרוטונין הוא כלי נוסף כדי לחקור התאוששות של דיכאון הסינפטי ואפשרות אמצעי לקידום חקירת גיוס של בריכות שלפוחית ​​סינפטית. הכנה זו מספקת יתרונות ניסיוניים אחדים, מאז סיבי שריר בודדים מעוצבבים על ידי נוירונים המנוע הן phasic טוניק.

מאז סרוטונין מגדילה את מספר שלפוחית ​​שפורסמו עם גירוי מעורר, ומאז הוא מקדם את ההחלמה במהלך דיכאון, ברור כי יש אפנון של בריכות שלפוחית ​​לשיפור ההסתברות של התמזגות עם ההווה סרוטונין (ג'ונסטון et al. 2008 ; לוגסי ואח', 2006;. ניצוצות et al, 2004).. מודלים שיסבירו את הדינמיקה של בריכות שלפוחית ​​בתוך הטרמינל עצב presynaptic במהלך גירוי בתדר נמוך, בניגוד למצב מדוכא, גם צריך להיחשב בין פרוטוקולי הניסוי השונים אפשרי עם הכנה זו.

זה כבר ציין מערכות אחרות כי כ -30% הבריכה שלפוחית ​​עובר מיחזור מהיר, בעוד שאר שלפוחית ​​ממוחזרים לעבור נתיב מיחזור המסורתית איטי דרך reticulum endoplasmic (Harata et al, 2001;. צ'יין et al. , 2001). נתיבי כפול כזה עשוי גם להיות נוכח במערכת זו. אם ה-ATP חסר במדינה מדוכאת של המסוף presynaptic, אז עגינה undocking לא יוכל להתרחש, ולכן שלפוחית ​​פרקו ועוד יישאר על פני השטח הסינפטי. מאז שלפוחית ​​יותר משתחררים במהירות כאשר מסופי נחשפים HT 5, זה אינו ריאלי, כי עוד נמצאים בתוך הבריכה releasable בקלות (RRV). עם זאת, במדינה מדוכאת, עם הפחתת ה-ATP, עגינה ו undocking עשויים להיחסם אפילו בנוכחות של 5-HT, אשר פרקו שוב עלים שלפוחית ​​על פני השטח הסינפטי. מאז נתונים ראשוניים עולה כי שלפוחית ​​יותר משתחררים לאורך זמן עם חשיפה ממושכת HT 5 וגירוי, חלוקת הבריכה שלפוחית ​​מן השבילים מיחזור מהיר ואיטי עשוי להיות מוטה יש שלפוחית ​​המוסמכת לשחרור מחדש (מ ג'ונסטון et al. , 2008; לראות ביקורות, דסאי, השאה et al, 2008;. דסאי, השאה קופר, 2009)

עם הטכניקות של הקלטות macropatch מוקד של זרמים postsynaptic ואמצעים הקוונטים אחד מאזורים מוגדרים של הטרמינל עצב מוטורי, אפשר לשאול שאלות כדי לקבוע אם הדיכאון הסינפטי מתרחש כתוצאה של שלפוחית ​​פחות ששוחרר או בגלל שינויים של הפונקציה של קולטנים postsynaptic. הוכח כי שלפוחית ​​רגישים יותר היתוך NMJ phasic של הכנה זו לחשיפה סידן שווה (Miller et al. 2005), המהווה סביר גבוה יותר פירושו תוכן quantal של המסופים phasic (Msghina et al. , 1998, 1999). בנוסף, ההבדלים frequenin חלבון מחייב סידן (Jeromin et al. 1999) ו ultrastructure (המלך et al. 1996) לתרום ליעילות ההפרש הסינפטי (קופרet al., 2003).

לפני כמה מחקרים בחנו את הפנוטיפ שרירים של סיבי שריר פושטי (Bradacs et al, 1997;. Cooper et al, 2003).. השוואת תקנה של בידול שריר עבור סוגי סיבים טוניק טהורה phasic ב סרטנים סוגי סיבים מעורבים, כמו עבור extensor את הרגל כי הוא innervated עמומות, יוכל לספק רמזים הביטוי שריר פנוטיפ ורגולציה (LaFramboise et al, 2000;. סון et al, 2000;. Griffis et al, 2001;. Mykles et al, 2002)..

שאלות מהותיות רבות נותרו להתייחס בנוירוביולוגיה, והכנה זו עשויה לסייע בהתמודדות עם כמה מהם. נושאים מעטים עניין בתחום היום כי יכול להיות ניגש עם פושטי הרגל כוללים: 1) קביעת מנגנונים הסלולר העומדים בבסיס דיכאון הסינפטית בתוך מסופי תפוקה גבוהה (האם דיכאון בשל הפחתה של Ca2 + כניסה, חוסר מוסמך בקלות שלפוחית ​​releasable (RRV) בריכה, ו / או פתיחות postsynaptic שינו?) 2) קביעת תפקיד מכניסטית של 5-HT כאשר מיושם לאחר גיוס של דיכאון הסינפטי לקדם התאוששות מהירה יותר, ו 3) הקביעה האם הצורות של quantal זרמים הנובעים מסופי phasic מגרה נמצאים שינו במהלך גיוס של דיכאון כדי לטפל ברכיבים טרום ופוסט סינפטיים של דיכאון הסינפטי.

NMJ זו חשובה כדי מחקר מתמשך והחוקרים בעתיד כי זה מאפשר לנו לקבל מידע רלוונטי, כי כתובות המנגנונים זוטר של ביצועים הסינפטית, כפי שהיא נמדדת ישירות באתרי שחרור. מחקרים עדכניים בתחום זה היא מתן מידע על אפנון של דיכאון הסינפטי ע"י 5-HT ואת הדינמיקה של בריכות שלפוחית. נושאים אלה נוגעים את היסודות הבסיסיים של תמסורת הסינפטי רלוונטי כל מערכות עצביות.

Materials

Crayfish (Procambarus clarkii). Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA., USA. Standard crayfish saline: Modified from Van Harreveld's solution (1936). (in mM) 205 NaCl; 5.3 KCl; 13.5 CaCl22H2O; 2.45 MgCl26H2O; 5 HEPES and adjusted to pH 7.4 Dissection tools: Fine #5 tweezers, fine scissors, knife blade holder, #26002-20 insect pins (all obtained from Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139) Sylgard coated dissection dish, a recording dish either constructed with suction electrode or use a suction electrode and anther manipulator to hold a suction electrode. Dissecting microscope with zoom function for intracellular recordings. For focal recording on visualized terminals a compound microscope with upright objectives (4 x and 20X) is used. One needs a Hg light source. Standard intracellular amplifier and A/D board for on line recording to a computer. Electrical signals are recorded on line to a PowerLab/4s interface (ADInstruments, Australia). We use standard software from ADInstruments named Chart or Scope. Chemicals: We use a vital fluorescent dye, 4 [4 (diethylamino) styryl] N methylpyridinium iodide (4 Di 2 Asp; Molecular Probes, Eugene, OR), to visualize the varicosities (Marigassi et al., 1987; Cooper et al., 1995a). All saline chemicals were obtained from Sigma chemical company (St. Louis, MO). For intracellular recordings we use glass capillary tubing (catalogue # 30-31-0 from FHC, Brunswick, ME, 04011, USA) and for focal macropatch electrodes we use Kimax-51, Kimble Products Art. No. 34502, ID 0.8-1.1mm, length 100mm. The intracellular electrode should have a resistance of 20 to 30 mOhm. The macropatch electrode is constructed by breaking off the tip of the glass after a fine tip was made from an electrode puller. The broken off tip needs to be a clean perpendicular break about 20μM in diameter. The tip is then heat polished to about 10μM inner diameter. The shaft of the electrode is then run over a heating element to cause it to bend about 45 degrees with a gradual bend. This produces a flat or perpendicular electrode lumen over the nerve terminal as the angle with the micro-manipulator will produce about another 45 degrees to the preparation.