Fysiologische Opnamen van hoge en lage Output NMJs op de Crayfish Leg Extensor Muscle

Summary

Dit artikel legt uit hoe u elektrofysiologische opnames van synaptische reacties gedrag op de extensoren spier in de wandel-poot van een kreeft en hoe de zenuwuiteinden zijn gevisualiseerd op de bruto-morfologische verschillen tussen hoog-en laag-output zenuwuiteinden te tonen.

Abstract

We leggen in detail uit hoe bloot te leggen en de elektrofysiologische opnames van synaptische reacties te voeren voor hoge (fasische) en lage (tonic) output neuronen innerveren de extensoren spier in de wandel-poot van een kreeft. Duidelijke verschillen aanwezig zijn in de fysiologie en morfologie van de fasische en tonische zenuwuiteinden. De tonica axon bevat veel meer mitochondriën, waardoor het te nemen een belangrijke vlek intensiever dan de driefase axon. De tonic terminals hebben varicosities, en de driefase aansluiting is filoremische. De tonic terminals zijn laag in de synaptische efficiëntie, maar tonen dramatisch vergemakkelijkt reacties. In tegenstelling, de driefase terminals hoog in quantale effectiviteit, maar tonen synaptische depressie met een hoge frequentie stimulatie. De quantale output wordt gemeten met een focale macropatch elektrode direct geplaatst over de gevisualiseerde zenuwuiteinden. Zowel de fasische en tonische terminals innerveren dezelfde spiervezels, waarin staat dat inherente verschillen in de neuronen, in plaats van differentieel retrograde feedback van de spier, verantwoordelijk voor de morfologische en fysiologische differentiatie suggereert.

Protocol

1) Inleiding

Motorneuronen communiceren met een spiervezel bij synapsen die gezamenlijk worden aangeduid als een neuromusculaire junctie (NMJ). NMJs is gemakkelijk te bereiken in de meeste kreeften spier preparaten. Veel van de rivierkreeft NMJs tonen niet-stekelige excitatoire postsynaptische potentialen (EPSP), vergelijkbaar met de gesorteerde elektrische signalen gegenereerd in postsynaptische dendrieten in het zoogdier CZS of subthreshold reacties genoteerd in gewervelde NMJs (Wiersma & Van Harreveld, 1938; Katz & Kuffler, 1946) . De rivierkreeft NMJs kan dienst doen als fundamenteel synaptische modellen om algemene inzichten te verschaffen in synaptische transmissie en synaptische differentiatie.

In het algemeen, motor-eenheden regelen aspecten van het dierlijk gedrag via de aard van de synaptische communicatie in NMJs en eigenschappen van de spieren. Sinds de eerste waarneming van "snelle" en "slow" spiercontracties in de krab en kreeft dichter spier (Lucas, 1907, 1917), heeft soortgelijke gespierd contractiele differentiatie is beschreven in andere kreeften spier types zoals abdominale buigspieren (Kennedy & Takeda, 1965a , b) en ledematen extensoren (Van Harreveld & Wiersma, 1936). "Fast" weeën beginnen snelle reacties. Bijvoorbeeld, de rivierkreeft staart flip is een snelle gedrag. "Slow" contracties onderhouden langzame bewegingen en het handhaven van lichaamshouding (Bradacs et al.., 1997). Die overeenkomt met "snel" en "slow" spiercontracties, "fasisch / hoge output 'en' tonic / low output 'zijn over het algemeen gebruikt om de motor neuronen te beschrijven. Het verschil in snelheid en de timing van de spieren is voor een deel gerelateerd aan verschillen in de presynaptische synaptische structuur en synaptische sterkte (King et al., 1996).. Myofibrillar proteïne isovorm expressie is ook belangrijk in contractiele verschillen, maar in preparaten zoals die van het been extensor spier, waarbij een bepaalde vezel wordt geïnnerveerd door beide soorten van motor neuronen, ligt de focus op synaptisch verschillen van de terminals, omdat de terminals te delen dezelfde doelcel (Mykles et al.., 2002). Een eerdere studie onderzocht de twee prikkelende motor axonen van het been extensor en beschreef de fasische en tonische fenotypen (Bradacs et al.., 1997). In dit rapport tonen we aan hoe de dissectie uit te voeren en het verkrijgen van opnames, zodat anderen verder kunnen onderzoeken de eigenschappen van de synaptische differentiatie van deze zenuwuiteinden.

Bekeken met transmissie elektronenmicroscopie, diverse series van de secties verkregen uit de tonic en driefase-terminals op de rivierkreeft been extensoren spier bleek dat tonic terminals meer RRP blaasjes dan fasisch terminals bevatten, de mitochondriën komen vaker voor in tonic neuronen en synapsen op de driefase-terminals complexer dan die op het lage-output synapsen, want zij bevatten meerdere actieve zones met gevarieerde afstanden (Miller et al., 2002; Johnstone et al., 2008;. King et al., 1996;.. Bradacs et al., 1997). De lage-output tonic terminals zijn ook meer vatbaar voor verbetering van synaptische transmissie met de neuromodulator serotonine (5-HT) dan zijn de driefase terminals (Cooper et al.., 2003).

Het feit dat de tonic en driefase NMJ aanwezig zijn op dezelfde spiervezels maakt het gemakkelijker om presynaptische verschillen op een gegeven spiervezels te beoordelen en om vragen van spiervermoeidheid, synaptische depressie en synaptische overspraak te pakken. Verschillende vragen moeten nog worden aangepakt in dit preparaat, zoals de vraag of er verschillen zijn in de postsynaptische receptor dichtheid en glutamaat receptor subtypes in postsynaptische doelstellingen voor de tonic en driefase terminals, maar een beter begrip van de fundamentele verschillen in de anatomie en fysiologie van deze twee motor-eenheden zullen helpen bij het opbouwen van een meer diepgaande kennis. De hoop is dat de fundamentele beginselen geleerd in deze synaptische voorbereiding zal van toepassing zijn op andere synapsen in diverse voorbereidingen en zal de toekomstige onderzoeken in deze synaptische model van de rivierkreeft.

2) Methods

1. Alle experimenten worden uitgevoerd op de eerste of tweede lopen de benen van middelgrote rivierkreeft (Procambarus clarkii). De dieren worden individueel gehuisvest in plastic containers met oxygenized water. De temperatuur van het dier kamer is in het bereik van 13 ° C-16 ° C. De dieren worden gevoed met droog visvoer en het water veranderd op een wekelijkse basis.
   
   
   Figuur 1: Schema van een rivierkreeft wandel-been en de zes distale segmenten.
2. De distale aspect van het lopen been in een rivierkreeft is anatomisch onderverdeeld in zes segmenten (Figuur 1). Het been extensor bevindt zich in de meropodite, en de zenuw bundel die zal worden geïsoleerd is dicht bij de meropodite ischiopodite gewricht. De tonic of driefase axon kan selectief worden gestimuleerd als needed voor fysiologische doeleinden nadat ze zijn blootgesteld.
3. Cooper en Cooper (2009) beschreef een aantal aspecten van de eerste dissectie, inclusief methodes voor het blootstellen van de Excitor van de opener motor neuron binnen de meropodite regio, maar hun beschrijving voorziet niet in de zorg die nodig is voor de bescherming van de extensor spieren tegen beschadiging, zoals het was niet nodig om de opener spier voorbereiding adres. Om de extensor te beschermen, is de eerste of tweede etappe lopen verwijderd van de rivierkreeft, het meten van 6-10 cm in lichaamslengte (Atchafalaya Biological Supply Co, Raceland, LA), door het induceren van het dier aan de ledematen Automize met krachtig knijpen distaal van de fractuur vliegtuig in de ischiopodite segment. Het been wordt geplaatst op de dissectie plaat met de laterale (buitenzijde) met uitzicht op de kijker. Het been is omgedraaid totdat de kijker kan er zeker van de buitenkant (laterale zijde) is gericht op het ontleden plaat, meestal met de gebogen kant naar boven (figuur 2). Het plaatsen van het been op een stukje weefsel papier maakt het makkelijker om de voorbereiding draaien, terwijl het maken van deze bezuinigingen.
   
   
   Figuur 2: De laterale zijde van de meropodite, meestal de kant die is gewelfd, wordt naar boven op de dissectie plaat.
4. Met een scalpel breaker en houder, is een scherp scheermesje gebruikt om etsen van de cuticula tot net snijden door in het patroon in figuur 3 voor de meropodite segment. Zorg wordt genomen om niet te ver distaal bezuinigen op de rug te ventrale gesneden door de meropodite-carpopodite gewricht.
   
   
   Figuur 3: De meropodite segment met lijnen als een voorgesteld patroon voor het etsen uit het raam van cuticula.
   
   
   Het preparaat wordt geplaatst in een zoutoplossing. De dissectie schotel moet een Sylgard (Dow Corning) coating aan de onderkant (1 cm dik). De Sylgard wordt gebruikt, zodat insecten pinnen kunnen worden geplakt in het voor het houden van de voorbereiding nog steeds. Op dit punt is een pin vast in het midden van de carpopodite segment en in het dorsale aspect van de ischiopodite segment (figuur 4). Ontleed voorbereidingen badend in standaard rivierkreeft zoutoplossing, gewijzigd uit de oplossing van Van Harreveld s (1936), die is gemaakt met 205 NaCl, 5.3KCl; 13,5 CaCl _2; 2H ₂ O; 2,45 MgCl _2; 6H ₂ O, 5 HEPES en aangepast aan de pH 7,4 (in mm).
   
   
   
   Figuur 4: De meropodite segment met gesneden venster wordt getild. Let op de locatie van de dissectie pinnen.
5. De cuticula is tilde in de distale regio en de spiervezels worden gesneden uit de buurt van de nagelriem door het maken van slagen naar de basis van het been. De cuticula kan worden getild.
6. De apodeme (pees) is afgesneden op de meropodite-carpopodite gewricht. Een pin is geplaatst op de binnenkant van de flexor pees te laten zien waar de snede moet worden gemaakt (figuur 5). De pees is dan geknepen waar hij werd gesneden met een pincet en de flexor spier getrokken uit door te tillen in een caudale richting (Figuur 6), waardoor de belangrijkste poot zenuw en de extensor spieren.
   
   
   Figuur 5: De apodeme van de m. flexor spier wordt gemarkeerd door het verplaatsen van het van de flexor met een speld.
   
   
   
   Figuur 6: De apodeme van de m. flexor spier wordt gesneden en met zorg verwijderd als niet aan de belangrijkste poot schade aan de zenuwen.
7. De belangrijkste poot zenuw wordt doorgesneden bij de meropodite-carpopodite joint en zorgvuldig getrokken terug over de extensor spieren. De mediale oppervlak van de spier wordt gebruikt in deze studie. De scheiding van de zenuw naar de spier extensor van de belangrijkste been zenuw kan worden verbeterd door voorzichtig te trekken de distale stomp van de belangrijkste been zenuw aan de zijkant van het preparaat. Als peeling van het hoofdkanaal been zenuw over de extensor spieren, kunnen kleine takken van de axon moeten worden gesneden. Dit zijn takken van de remmende motor neuron naar de extensor spieren. De grotere bundel vertakt off van de belangrijkste been zenuw in de buurt van het proximale uiteinde van de meropodite is de kleine zenuw bundel van belang.
   
   
   Figuur 7: De belangrijkste poot zenuw wordt doorgesneden en terug getrokken in een proximale richting.
   
   
   Deze zenuw bundel kan gezien worden met methyleenblauw kleuring (figuur 8) of met 4-Di-2-ASP fluorescerende vlek (Figuur 9).
   
   
   
   Figuur 8: De extensor spieren gekleurd met methyleenblauw. Let op de axon vertakking en de twee goed zichtbaar axonen in de zenuw. Rode pijlen Demark de zenuw track.
   
   
   
   Figuur 9: De axonen van de motorische zenuw gekleurd met 4-Di-2-ASP. De tonic axon is meer helder zichtbaar is te wijten aan de verhoogde mitochondriale inhoud.
   
   
   Figuur 10a: Individuele terminals van fasische en tonische neuronen gekleurd met 4-Di-2-ASP. Let op de varicosities op de tonica terminals en de dunne de aard van de driefase terminals.
   
   
   
   Figuur 10B-Tonic opgemerkt
   
   
   
   Figuur 10C-fasisch opgemerkt

3) Fysiologische Profielen

1. Te houden aan de prikkelende postsynaptische potentialen (EPSPS) van de tonische of fasische neuronen, is een van de geïsoleerde axonen in de zenuw bundel gestimuleerd door een zuig-elektrode (Figuur 11) is aangesloten op een Grass stimulator terwijl intracellulaire potentialen in de spier worden bewaakt (Johnstone et al.., 2008). Stimulatie bij 70 Hz wordt toegepast op de tonica axon om een ​​gefaciliteerde reactie voor de lage output NMJs te bevorderen, of een enkele puls (1 Hz) wordt toegepast op de driefase axon om grote epsps van de hoge output te krijgen NMJs zoals in Figuur 12. De EPSPS worden opgeslagen op een computer via een PowerLab/4s interface.
   
   
   Figuur 11: Het stimuleren van elektrode geplaatst over een axon in de zenuw bundel. Let op de groene lijn waarin de twee belangrijkste axonen.
   
   
   
   Figuur 12: Postsynaptische potentials (EPSPS) van de tonische of fasische neuronen zoals verkregen door intracellulaire opnames.
2. Onderzoek in de aard van synaptische faciliteren en synaptische depressie kan worden benaderd door verschillende experimentele paradigma's met de lage en hoge output NMJs. Faciliteren van de lage output NMJs hangt af van de frequentie, zoals getoond voor de 20, 40 en 60 Hz pulsen van ongeveer 20 stimuli (figuur 13).
   
   
   Figuur 13: EPSPS in reactie op een trein van stimulatie pulsen gegeven op drie verschillende frequenties 20, 40 en 60 Hz in normale rivierkreeft zoutoplossing.
3. Het tarief van de synaptische depressie om de frequentie van de stimulatie is ook gerelateerd aan de hoge output NMJs. Figuur 14 toont een continue 5 Hz stimulatie van het indrukken van de NMJ meer dan 30 minuten. Met hogere stimulatie frequentie, zal de voorbereiding druk sneller (Bradacs et al.., 1997).
   
   
   Figuur 14: EPSP amplitude van de fasische respons gedurende 5 Hz stimulatie om depressie te veroorzaken.

4) quantale Reacties

1. Een soortgelijke procedure die beschreven voor de opener spieren van de rivierkreeft (Cooper en Cooper, 2009) is gebruikt in deze voorbereiding. De quantale EPSPS direct over herkenbare regio's van het zenuwuiteinde worden opgenomen door het plaatsen van het lumen van een macro-patch registratie-elektrode op de synaptische varicosities gevisualiseerd met de vitale kleurstof 4-Di-2-Asp (5 uM, 5-minuten behandeling, Cooper et al., 1995;. Magrassi et al., 1987).. De spontane en riep quantale antwoorden kunnen worden opgenomen langs de zenuwuiteinden. De opgeroepen en spontane synaptische potentialen worden opgenomen met de macro-patch elektrode (Dudel, 1981; Wojtowicz et al., 1991;. Mallart, 1993). Kimax glas (buitendiameter: 1,5 mm) werd getrokken en vuur-gepolijst om patch tips te produceren met binnenin een diameter van 10 tot 20 urn (figuur 15).
   
   
   Figuur 15: Het lumen van een macro-patch registratie-elektrode.
   
   
   Het lumen van de elektrode wordt gevuld met het baden medium. De versterker is dezelfde als die gebruikt worden voor de intracellulaire opname hierboven vermeld. Elektrode en seal weerstand kan worden bepaald door het passeren teststroom pulsen door de elektrode. In onze experimenten, afdichting weerstanden varieerde 0,3 tot 1,0 MOhm en de elektrode weerstand varieerde 0,5 tot 1,0 MOhm. Seal weerstand kan worden gecontroleerd in de opname.
2. Directe tellen van quantale evenementen is het mogelijk met een lage stimulatie frequenties. Voor elke opgewekte reacties, kan het aantal quantale gebeurtenissen gemakkelijk worden bepaald voor de lage output terminals (figuur 16). Deze directe tellingen kunnen helpen schatten het gemiddelde quantale inhoud (Del Castillo & Katz, 1954;. Cooper et al., 1995). Sinds de opgeroepen hoge output NMJs produceren multi-quantale opgeroepen evenementen, de gemiddelde amplitude of gebied van de doorbuiging, samen met de gemiddelde piek amplitude of het gebied van de spontane gebeurtenissen, kan worden gebruikt om passendeximate het gemiddelde quantale inhoud (Cooper et al.., 1995).
   
   
   Figuur 16 Focale sporen opgenomen van een driefase en een tonic NMJ.
   
   
   Figuur 17

Discussion

We hebben aangetoond in dit rapport hoe te ontleden, te registreren en kwantificeren synaptische reacties in een unieke rivierkreeft neuromusculaire preparaat waarin zowel hoge-en lage-uitgangsklemmen innerveren dezelfde spiervezels. De neuromusculaire voorbereidingen in de rivierkreeft bieden vele voordelen ten opzichte van gewervelde neuromusculaire verbindingen, aangezien slechts een paar prikkelende motorische neuronen zijn nodig om een ​​spier innerveren, en aangezien de neuronen zijn herkenbaar aan de voorbereiding tot de voorbereiding (Atwood, 1976). Daarnaast is de excitatoire neurotransmitter glutamaat is, en de excitatoire postsynaptische potentialen (EPSP) worden gesorteerd, dus de biofysische eigenschappen van gesorteerde gebeurtenissen zijn analoog aan de dendrieten van de neuronen in het CZS van de gewervelde dieren. De quantale stromingen, echter rechtstreeks kan worden gevolgd op de postsynaptische sites (Cooper et al.., 1995).

Repetitieve 5 Hz stimulatie van de driefase zenuw geeft aanleiding tot grote EPSPS die sterk depressief na enkele minuten. Dit type van depressie komt vaak voor bij geleedpotigen fasisch neuromusculaire verbindingen (Atwood en Cooper, 1996). De aanwezigheid van de tonica terminals langs de driefase terminals maakt het mogelijk om te beoordelen of de postsynaptische doelgroep sterk wordt gewijzigd tijdens en na de depressie van de driefase motor neuron. Daarnaast is de lage output terminals bieden ook een mooie voorbereiding op de mechanismen die ten grondslag liggen te onderzoeken synaptische facilitatie (Desai-Shah et al., 2008;. Desai-Shah en Cooper, 2009)

De hoge uitgangsklemmen bieden een speeltuin aan de modulatie te onderzoeken in het tempo van de synaptische depressie en het herstel proces. Toegankelijk en levensvatbare voorbereidingen moeten helpen in het ontcijferen van de mechanismen achter synaptische depressie. In deze rivierkreeft been extensor voorbereiding, exogene toepassing van serotonine is een ander middel om het herstel van synaptische depressie en mogelijk een middel om het bevorderen van onderzoek naar de mobilisatie van synaptische vesicles zwembaden te onderzoeken. Dit preparaat biedt een aantal experimentele voordelen, aangezien individuele spiervezels worden geïnnerveerd door zowel driefase-tonic motorneuronen.

Omdat serotonine verhoogt het aantal blaasjes die zijn vrijgegeven met opgeroepen stimulatie, en omdat het bevordert het herstel tijdens een depressie, blijkt dat er een modulatie van het blaasje zwembaden voor het verbeteren van de kans op fusie met serotonine aanwezig zijn (Johnstone et al.., 2008 ; Logsdon et al., 2006;. Sparks et al., 2004).. Modellen die de dynamiek van het blaasje zwembaden zou binnen de presynaptische zenuwuiteinde uit te leggen tijdens de lage frequentie stimulatie, in tegenstelling tot een depressieve toestand, ook moeten worden gerekend tot de verschillende experimentele protocollen die mogelijk zijn met deze voorbereiding.

Het is opgemerkt in andere systemen, dat ongeveer 30% van het blaasje pool een snelle recycling ondergaat, terwijl de rest van de gerecycleerde blaasjes gaan door een traditionele slow recycling pad door het endoplasmatisch reticulum (harata et al., 2001;. Tsien et al.. , 2001). Dergelijke dubbele paden kunnen ook aanwezig zijn in dit systeem. Als ATP ontbreekt in de depressieve toestand van de presynaptische terminal, vervolgens vastzetten en losmaken misschien niet in staat zijn om zich voordoen, dus veel meer gelost blaasjes zou blijven op het synaptische oppervlakte. Sinds meer blaasjes worden snel vrijgegeven wanneer de klemmen worden blootgesteld aan 5 HT, is het mogelijk dat er meer zijn opgenomen in het gemakkelijk losneembaar zwembad (RRV). Echter, in de depressieve toestand, met verminderde ATP, kan het docking en loskoppelen geblokkeerd worden, zelfs in de aanwezigheid van 5 HT, wat ook weer gelost blaasjes bladeren aan de synaptische oppervlakte. Omdat de voorlopige gegevens blijkt dat er meer blaasjes worden vrijgegeven na verloop van tijd met verlengde 5 HT blootstelling en stimulatie, de verdeling van het blaasje zwembad van het snelle en langzame recycling paden kunnen worden scheefgetrokken aan de bevoegde blaasjes voor de re-release (van Johnstone et al. hebben. , 2008, zie reviews-Desai-Shah et al., 2008;. Desai-Shah en Cooper, 2009)

Met de technieken van focale macropatch opnames van postsynaptische stromingen en maatregelen van enkele quanta Uit afgebakende gebieden van de motorische zenuw-terminal, kan men vragen stellen om te bepalen of synaptische depressie is ontstaan ​​als gevolg van minder blaasjes wordt vrijgegeven of door wijzigingen van de functie van postsynaptische receptoren. Het is aangetoond dat de blaasjes zijn gevoeliger voor fusie bij de driefase NMJ van dit preparaat voor een gelijke blootstelling aan calcium (Miller et al.. 2005), die waarschijnlijk goed is voor de hogere quantale inhoud van de driefase terminals (Msghina et al. betekenen. , 1998, 1999). Bovendien verschillen in de calcium-bindend eiwit frequenin (Jeromín et al.., 1999) en ultrastructuur (King et al., 1996). Bijdrage leveren aan de differentiële synaptische werkzaamheid (Cooperet al.., 2003).

Sommige eerdere studies hebben onderzocht de spier fenotype van de extensor spiervezels (Bradacs et al., 1997;. Cooper et al., 2003.). Vergelijking van de regulering van de spier differentiatie voor zuiver tonic en driefase soorten vezels in de rivierkreeft op gemengde vezeltypen, zoals voor het been extensor dat dof is geïnnerveerd, kan aanwijzingen geven om spieren fenotype expressie en regelgeving (Laframboise et al., 2000;. Sohn et al., 2000;. Griffis et al., 2001;. Mykles et al., 2002)..

Veel fundamentele vragen moeten nog worden aangepakt in de neurobiologie, en dit preparaat kan steun bij de aanpak van een aantal van hen. Een aantal onderwerpen die van belang op het gebied vandaag de dag die kunnen worden benaderd met het been extensor zijn onder meer: ​​1) Het bepalen van de cellulaire mechanismen die de synaptische depressie ten grondslag liggen binnen de high-output terminals (Is de depressie te wijten aan een vermindering van de Ca2 + toegang, het ontbreken van een bevoegde gemakkelijk losneembaar vesicle (RRV) zwembad, en / of gewijzigd postsynaptische ontvankelijkheid?) 2) Bepalen van de mechanische rol van 5-HT wanneer het wordt aangebracht na de inductie van synaptische depressie tot een sneller herstel, en 3 te bevorderen) Bepalen of de vormen van de quantale stromen die voortvloeien uit het stimuleren van driefase-terminals worden gewijzigd tijdens de inductie van depressie pre-en post-synaptische componenten van synaptische depressie te pakken.

Dit NMJ is belangrijk om voortdurend onderzoek en toekomstige onderzoekers, omdat het ons in staat stelt te verkrijgen relevante informatie die de ondergeschikte mechanismen van synaptische prestaties direct gemeten bij de release plaatsen adressen. Het huidige onderzoek op dit gebied is het verstrekken van informatie over de modulatie van synaptische depressie door 5-HT en de dynamiek van het blaasje zwembaden. Dergelijke onderwerpen hebben betrekking op de fundamentele grondbeginselen van synaptische transmissie relevant voor alle neurale systemen.

Materials

Crayfish (Procambarus clarkii). Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA., USA. Standard crayfish saline: Modified from Van Harreveld's solution (1936). (in mM) 205 NaCl; 5.3 KCl; 13.5 CaCl22H2O; 2.45 MgCl26H2O; 5 HEPES and adjusted to pH 7.4 Dissection tools: Fine #5 tweezers, fine scissors, knife blade holder, #26002-20 insect pins (all obtained from Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139) Sylgard coated dissection dish, a recording dish either constructed with suction electrode or use a suction electrode and anther manipulator to hold a suction electrode. Dissecting microscope with zoom function for intracellular recordings. For focal recording on visualized terminals a compound microscope with upright objectives (4 x and 20X) is used. One needs a Hg light source. Standard intracellular amplifier and A/D board for on line recording to a computer. Electrical signals are recorded on line to a PowerLab/4s interface (ADInstruments, Australia). We use standard software from ADInstruments named Chart or Scope. Chemicals: We use a vital fluorescent dye, 4 [4 (diethylamino) styryl] N methylpyridinium iodide (4 Di 2 Asp; Molecular Probes, Eugene, OR), to visualize the varicosities (Marigassi et al., 1987; Cooper et al., 1995a). All saline chemicals were obtained from Sigma chemical company (St. Louis, MO). For intracellular recordings we use glass capillary tubing (catalogue # 30-31-0 from FHC, Brunswick, ME, 04011, USA) and for focal macropatch electrodes we use Kimax-51, Kimble Products Art. No. 34502, ID 0.8-1.1mm, length 100mm. The intracellular electrode should have a resistance of 20 to 30 mOhm. The macropatch electrode is constructed by breaking off the tip of the glass after a fine tip was made from an electrode puller. The broken off tip needs to be a clean perpendicular break about 20μM in diameter. The tip is then heat polished to about 10μM inner diameter. The shaft of the electrode is then run over a heating element to cause it to bend about 45 degrees with a gradual bend. This produces a flat or perpendicular electrode lumen over the nerve terminal as the angle with the micro-manipulator will produce about another 45 degrees to the preparation.