ザリガニの脚の伸筋に高と低出力NMJsの生理的録音

Published: November 17, 2010 doi: 10.3791/2319

Wen Hui Wu*¹, Robin L. Cooper*¹

¹Department of Biology, University of Kentucky

* These authors contributed equally

Summary

この記事では、ザリガニの歩行足に伸筋のシナプス応答の電気生理学的記録を行い、どのように神経終末が高と低出力の神経終末の総形態的な違いを示すために可視化する方法を示します。

Abstract

我々は高い（一過性）、低（トニック）出力の運動ニューロンは、ザリガニの歩行足に伸筋を支配するためのシナプス応答の電気生理学的記録を公開し、実施するのかを詳細に説明。明確な違いは、一過性および持続性神経終末の生理学と形態で存在している。強壮剤の軸索は、それがもっと激しく相動軸索より生体染色法を利用できるように、より多くのミトコンドリアの多くが含まれています。トニック端末はvaricositiesを持っている、と相性の端末は糸状です。トニック端末はシナプス伝達効率が低いですが、劇的な促進反応を示しています。対照的に、相動端末は量子効果の高いが、高頻度刺激でシナプス抑制を示す。量子出力は、可視化の神経終末の上に直接配置された焦点macropatchの電極で測定されます。相動性および強壮剤の両方の端子には、形態学的および生理的分化のためのその神経細胞の本質的な違いではなく、筋肉からの差動逆行性フィードバック、アカウントを示唆している同一の筋線維を、刺激する。

Protocol

1）はじめに

運動ニューロンは、総称して神経筋接合部（NMJ）と呼ばれるシナプスにおける筋線維と通信します。 NMJsは、ほとんどのザリガニの筋肉の準備に簡単にアクセスすることができます。ザリガニのNMJsの多くは、脊椎動物のNMJsに記載されている哺乳類の中枢神経系または閾値以下の応答の中でシナプス後樹状突起で発生した段階的な電気信号に似て非スパイク興奮性シナプス後電位（EPSP）を示す（Wiersma＆ヴァンHarreveld、1938年、カッツ＆カフラー、1946）。ザリガニのNMJsは、シナプス伝達とシナプス分化に一般的な洞察を提供するために基本的なシナプスのモデルとして機能することができます。

一般に、運動単位は、筋肉のNMJsとプロパティでのシナプスのコミュニケーションのタイプを介して動物の行動の側面を規制する。カニやザリガニに近い筋肉（ルーカス、1907、1917）で"速い"と"遅い"筋肉の収縮の最初の観測以来、同様の筋肉の収縮分化はこのような腹部の屈筋（ケネディ＆武田、1965aなど、他のザリガニの筋肉の種類に記載されている、b）と四肢伸（ヴァンHarreveld＆Wiersma、1936）。 "高速"収縮は迅速に対応を開始。例えば、ザリガニの尾のフリップは、高速動作です。 "スロー"の収縮はゆっくりとした動きを維持し、（Bradacs ら、1997）姿勢を維持するのに役立ちます。 "速い"と"遅い"筋肉の収縮に対応する、"ハイ/相の出力"と"トニック/低出力は、"広義の運動ニューロンを記述するために使用されます。筋収縮の速度とタイミングの違いは、シナプスの構造とシナプス強度のシナプスの違い（キングら、1996）に部分的に関係する。筋原線維タンパク質アイソフォームの発現は、端末のシェアので、収縮の違いで、しかし、特定の繊維が運動ニューロンの両方のタイプによって支配され、フォーカスが端末のシナプスの違いになっている足の伸筋、のような準備にも重要です。同じ標的細胞（Mykles ら、2002）。以前の研究では、足の伸筋の二つ興奮モーターの軸索を検討し、相動性および持続性の表現型を（Bradacs ら、1997）に記載。このレポートでは、我々は、解剖を行い、他の人が、さらにこれらの神経末端のシナプス分化の性質を調べることができるように記録を取得する方法を示します。

透過型電子顕微鏡で見ると、ザリガニの足の伸筋の強壮剤と相動端末から得られたセクションの様々なシリーズは、強壮剤の端末が一過性の端末よりも多くのRRPの小胞を含んでいることが明らかになった。ミトコンドリアはトニックニューロンのより一般的であり、そして相性の端末でシナプスがありますより低出力のシナプス上にあるものよりも複雑な、彼らは様々な間隔で複数のアクティブなゾーンを含んでいるので（Miller ら、2002;ジョンストンら、2008;。。キングら、1996; Bradacs ら、1997。）。低出力のトニック端子も一過性の端子（Cooper ら、2003）よりも神経修飾物質のセロトニン（5 - HT）とシナプス伝達を強化を受けやすくなります。

トニックと相性NMJが同じ筋線維上に存在するという事実はそれが容易に特定の筋線維での前シナプスの違いを評価し、筋肉疲労、シナプス抑制とシナプスクロストークの問題に対処することができます。様々な質問には、強壮剤や相動端末の後シナプスにおけるターゲットのシナプス後受容体の密度とグルタミン酸受容体サブタイプの違いがあるかどうかのように、この準備のために対処されずに残っているが、これらの解剖学と生理学の基本的な相違の理解を深める2つのモータユニットは、より深遠な知識ベースを構築する際に役立ちます。希望は、このシナプスの準備で学んだ基本的な原理は、種々の製剤に他のシナプスにも適用になるとザリガニのこのシナプスモデルで将来の調査を強化することです。

2）方法

すべての実験は中規模ザリガニ（ ザリガニ ）の第一または第二歩行の脚で実施されています。動物は個別にoxygenized水とプラスチック容器に収容されています。動物室の温度が13 ° C - 16℃の範囲である動物は週単位で変更乾いた魚の餌と水が供給されています。

図1：ザリガニ歩いて足と6つの遠位のセグメントの回路図。
ザリガニの歩く脚の遠位面は解剖学的に6つのセグメント（図1）に分かれています。足の伸筋は長節に位置しており、分離されて神経の束は、長節坐骨関節に近接しています。強壮剤や相動性軸索が選択的にnと刺激することができるそれらが露出された後に生理的な目的のためにeeded。
クーパーとクーパー（2009年）長節領域内オープナー運動ニューロンの刺激神経を露出させるための方法を含む、初期の解剖のいくつかの側面を説明するが、それがあったとして、その説明は、損傷から伸筋を保護するために必要なケアを提供していませんオープナーの筋肉の準備に対処する必要はありません。伸筋を保護するために、第一または第二歩行の脚部は力強くつまんで手足をautomizeするために動物を誘導することによって、ボディの長さが6〜10センチメートル（アチャファラ生物サプライ（株）、レースランド、LA）を測定し、ザリガニから削除されます坐骨セグメントにおける破断面に遠位。脚部は、視聴者が直面している側面（外側）と解剖の板の上に置かれる。視聴者が外の（側面）（図2）通常アーチ型の側で、解剖のプレート上に上を向いていることを確認できるようになるまで、足を前後になっています。ティッシュの紙の上に足を置くと、これらの削減を行っている間、それは簡単に準備を変身させることができます。

図2：通常長節の側面、アーチしている側は、解剖のプレート上に直面している。
手術用メスの刃ブレーカとホルダーと、鋭いカミソリの刃は、ちょうど長節セグメントについては、図3に示すように、パターンの貫通切削までエッチングキューティクルするために使用されます。ケアは、長節、腕節の共同により、腹側のカットに背をはるかに遠すぎて切らないように取られます。

図3：キューティクルの窓から外をエッチングするための推奨パターンとして線で長節セグメント。

製剤は、生理食塩水に配置されます。解剖皿には、底部にSylgard（ダウコーニング）コーティング（厚さ1cm）を持つ必要があります。Sylgardが虫ピンがまだ準備を保持するためにそれにスタックできるように使用されます。この時点で、ピンは腕節セグメントの真ん中にと坐骨セグメント（図4）の背側面でスタックしています。解剖の準備は、標準的なザリガニ生理食塩水に浸し205 NaClで行われるヴァンHarreveld sソリューション（1936年）、から変更されています。5.3KCl、13.5のCaCl _{2、2H 2} O、2.45のMgCl _{2、6H 2} O、5 HEPESとするように調整pHは7.4（mMで）。

図4：リフトオフされているカットウィンドウで長節セグメント。解剖のピンの位置に注意してください。
キューティクルを穏やかに遠位領域で解除され、筋線維は脚部の底に向かってストロークすることにより、キューティクルから離れてカットされます。キューティクルをリフトオフすることができます。
内突起（腱）は長節-腕節ジョイントで切断されています。ピンはカットが行われるか（図5）場所を示すために屈筋腱の内面に配置されます。それはピンセットで切断された場所腱は、挟まれており、屈筋は、主脚の神経と伸筋を露出、尾側方向（図6）でそれを持ち上げることによってオフにプルアップ。

図5：屈筋の内突起はピンと屈筋から、それを置換することによって強調表示されている。

図6：主脚神経を損傷しないように屈筋の内突起をカットし、慎重に削除されます。
主脚の神経は、長節、腕節のジョイントで切断し、注意深く伸筋を介して引き戻される。筋肉の内側表面は、本研究で使用されています。主脚の神経から伸筋への神経の分離を穏やかに準備の側に主脚の神経の遠位断端を引っ張ることによって拡張することができます。伸筋を振り返って主脚の神経を剥離するときに、軸索の小枝をカットする必要があるかもしれません。これらは、抑制性運動ニューロンから伸筋への枝です。長節の近位端の近くに主脚の神経から分岐大きいバンドルには、関心の小さな神経の束である。

図7：主脚神経を切断し、近位方向に引き戻される。

この神経束は、メチレンブルー染色（図8）でまたはで見ることができる4 - ジ- 2 - ASP蛍光染色（図9）。

図8：メチレンブルーで染色した伸筋。軸索分岐と神経内の2つの容易に目に見える軸索に注意してください。赤い矢印demark神経トラック。

図9：4 -ジ- 2 - ASPで染色した運動神経の軸索。強壮剤の軸索が原因で増加したミトコンドリアのコンテンツに、より明るく表示されます。

図10A：4 -ジ- 2 - ASPで染色相動性および持続性ニューロンの個々の端末。トニック端末と相動端末の薄い性質上varicositiesに注意してください。

図10B -トニックは指摘する

図10C -相の指摘した

3）生理的プロファイル

筋肉の細胞内電位を監視している間、強壮剤や相動性ニューロンの興奮性シナプス後電位（EPSPの）観察するには、神経線維束の分離された軸索の一つは、（ジョンストングラスの刺激装置に接続された吸引電極（図11）によって刺激されら、2008）。 70 Hzの刺激は、低出力NMJsのための容易に反応を促進するために、トニックの軸索に適用される、または、単一のパルス（1Hz）で高出力の大きなEPSPのを得るために一過性軸索に適用されている図のようにNMJs図12インチEPSPのはPowerLab/4sインタフェースを介してコンピュータに記録されます。

図11：神経束内の単一の軸索上に配置刺激電極。 2つの主な軸索の輪郭を描く緑のラインに注意してください。

図12：細胞内記録で得られたとして、強壮剤や相動性ニューロンのシナプス後電位（EPSPS）。
シナプスの円滑化及びシナプス抑制の性質の調査は低いと高出力のNMJsで様々な実験パラダイムによって取り組むことができます。約20の刺激（図13）、20、40および60 Hzのパルスに対して示すように低出力のNMJsの促進は、周波数に依存します。

図13：通常のザリガニの生理食塩水で3つの異なった周波数20、40、60 Hzで与えられた刺激パルスのパルス列に対する応答のEPSPの。
刺激の周波数のシナプス抑制の率も高出力のNMJsに関連しています。図14は、30分以上NMJを押す刺激の連続的な5 Hzとを示しています。より高い刺激周波数で、準備は（Bradacs ら、1997）より急速に抑制される見込み。

図14：うつ病を誘発することが5Hzの刺激の間に相性反応のEPSPの振幅。

4）量子応答

ザリガニのオープナーの筋肉（クーパーとクーパー、2009）記載のものと同様の手順では、この準備のために使用されています。直接神経終末の識別可能な地域にわたって量子EPSPのは重要な染料4 -ジ- 2 - ASP（5μM、5分の治療、Cooper らによって可視化シナプスvaricositiesにマクロパッチの記録電極の内腔を配置することによって記録されます。ら、1995;。Magrassi ら、1987）。。自然だけでなく、誘発量子応答は神経終末に沿って記録することができます。誘発し、自発的なシナプス電位がマクロパッチ電極（Dudel、1981; Wojtowicz ら、1991;。Mallart、1993）で記録されます。 Kimaxガラス（外径：1.5 mm）を引っ張り、10〜20μmの（図15）に至るまでの内径とパッチのヒントを生成するためにファイアーポリッシュされた。

図15：マクロパッチの記録電極の内腔。

電極の内腔は、入浴媒体で満たされている。アンプは、上記の細胞内記録用に使用されるものと同じです。電極とシール抵抗は、電極を介してテスト電流パルスを渡すことによって決定することができます。我々の実験では、シール抵抗は0.3から1.0 Mohmをすることであったと電極の抵抗は0.5〜1.0 Mohmをすることであった。シール抵抗は録音を通してモニターすることができます。
量子イベントの直接計数は、低刺激の周波数で可能です。それぞれの誘発反応のために、量子イベントの数は、容易に低出力端子（図16）に決定することができます。これらの直接のカウントは、平均量子コンテンツ（。。Cooper ら、1995デルカスティー＆カッツ、1954）を推定することができます。誘発高出力NMJsはマルチ量子誘発イベント、自発的なイベントの平均ピーク振幅または面積とともにたわみの平均振幅または面積を、生成するので、適切に使用することができます。平均量子コンテンツ（Cooper ら、1995）ximate。

相動性および持続性NMJから記録された焦点距離のトレース図16。

図17

Discussion

我々は分析する方法、記録し、両方の高と低出力端末が同一の筋線維を支配するユニークなザリガニ神経筋の準備にシナプス応答を定量化するこのレポートに示されている。ザリガニの神経筋の製剤は、わずか数興奮性運動ニューロンは筋肉を支配するために必要ですので、脊椎動物の神経筋接合部に比べて多くの利点を提供し、神経細胞が準備から準備（アトウッド、1976）に識別可能であるため。さらに、興奮性神経伝達物質はグルタミン酸であり、興奮性シナプス後電位（EPSP）が採点され、したがって、段階的なイベントの生物物理学的特性は、脊椎動物の中枢神経系内のニューロンの樹状突起に似ています。量子電流は、しかし、後シナプス部位（Cooper ら、1995）で直接監視することができます。

相動性神経の反復的な5 Hzの刺激が大きく、数分後にうつ状態になる大きなEPSPのを生じさせる。うつ病のこのタイプは、節足動物相動性神経筋接合部（アトウッドとクーパー、1996）で共通です。相動端子と並んで強壮端末の存在は1つがシナプス後の目標を大幅に相動性運動ニューロンの抑うつの間と後に変更されているかどうかを評価することができます。（;デサイ- Shahさんとクーパー、2009年。デサイ-シャーら、2008）さらに、低出力端子には、シナプスの円滑化を根底にあるメカニズムを調べるために良い準備を提供する

高い出力端子は、シナプス抑制と回復過程の速度で変調を調査するためにプレイグラウンドを提供しています。アクセスおよび実行可能な準備がシナプス抑制の背後にあるメカニズムを解読するのに役立つはずです。このザリガニの足の伸筋の準備では、セロトニンの外因性のアプリケーションは、シナプス抑制とシナプス小胞プールの動員に調査を推進する潜在的な手段の回復を調べるために別のツールです。個々の筋線維が一過性と持続性の両方の運動ニューロンによって支配されているので、この準備には、いくつかの実験的な利点を提供します。

セロトニンは、誘発刺激で放出される小胞の数が増加し、それが不況時の回復を促進するので、それはセロトニンの存在（ジョンストンらとの融合の確率を高めるための小胞プールのいくつかの変調があることが明らかであるので。、2008年;ログスドンら、2006;らスパークス、2004）。。としてうつ状態とは対照的に、低頻度刺激時のシナプス前神経終末内の小胞プールのダイナミクスを説明するというモデルは、、また、この準備では不可能な様々な実験的なプロトコルの中で考慮する必要があります。

。ツィンら、それはリサイクル小胞の残りの部分は小胞体（原田ら、2001年までの伝統的な低速のリサイクルパスを通過するのに対し、小胞プールの約30％が、急速なリサイクルを受けることを他のシステムで注目されている。、2001）。このようなデュアルパスもこのシステムに存在することができる。 ATPはその後、シナプス前終末のうつ状態に欠けているドッキングとドッキング解除された場合に発生することができない場合があります、したがって、多くの無負荷時の小胞がシナプス表面に残っているでしょう。端子が5 HTにさらされているときに多くの小胞が急速に放出されるので、それはよりは容易に放出できるプール（RRV）に含まれていること可能です。しかし、うつ状態で、減少ATPで、ドッキングおよびドッキング解除は、さらに再びシナプス表面で無負荷時の小胞を離れる5 HT、の存在下でブロックされることがあります。予備的データは、より多くの小胞が長引く5 HTの曝露と刺激と時間をかけてリリースされることを示唆しているので、高速および低速リサイクルパスから小胞プールの分布は、再リリース（ジョンストンらのために有能な小胞を持つように偏りが発生する場合があります。、2008;。レビュー-デサイ- Shahさんら、2008を参照してください。デサイ- Shahさんとクーパー、2009）

シナプス後電流と運動神経終末の定義の領域から単一量子の対策の焦点macropatchの録音のテクニックを使うと、1つはシナプス抑制が解放される少数の小胞のため、または機能の変化の結果として発生しているかどうかを判断するために質問をすることができますシナプス後受容体。それは小胞がより高いために可能性が高いアカウントは相動端子（Msghina らの量子コンテンツを意味等しいカルシウムの暴露（Miller ら、2005）、のためのこの準備の相動NMJでの融合に敏感であることが示されている。、1998、1999）。さらに、カルシウム結合タンパク質のfrequenin（Jeromin ら、1999）と超微細構造（キングら、1996）の違いは、差動シナプス伝達効率（クーパーに貢献するら、2003）。

（; Cooper ら、2003。。Bradacsら、1997）、いくつかの先行研究では、伸筋線維の筋の表現型を調べてきました。混合繊維の種類のザリガニの純粋トニックと相性のファイバタイプの筋分化の調節を比較すると、、鈍い支配され、脚伸展のためにしたいと筋肉の表現型の発現と調節（ラフランバスら、2000年に手がかりを提供することができます。。孫らら、2000;。グリフィスら、2001;。Myklesら、2002）。。

多くの基本的な質問は神経生物学で対処されずに残っている、と本製剤は、それらのいくつかに取り組む際に助けることができる。足の伸筋に近づく可能性がある分野への関心、今日のいくつかのトピックが含まれます：1）高出力の端子の中でシナプス抑制の基礎となる細胞メカニズムの決定（Ca2 +のエントリの減少に起因するうつ病です、有能の欠如量子の形かどうかの判断容易に放出できる小胞（RRV）プール、および/または変更されたシナプス後受容性？）2）迅速な復旧、および3を促進するためのシナプス抑制の誘導後に適用するときに5 - HTの機構的役割の決定）刺激的な一過性の端子から発生する電流は、シナプス抑制のプレとポストシナプスのコンポーネントを対象にうつ病の誘導中に変更されています。

それは、私たちはリリースのサイトで直接測定されるシナプスのパフォーマンスのアンダーラインのメカニズムに対処する適切な情報を得ることができるため、このNMJは、継続的な研究と将来の研究者にとって重要です。この分野での現在の研究では5 - HTおよび小胞プールのダイナミクスによってシナプス抑制の変調についての情報を提供している。すべての神経システムに関連するシナプス伝達の基本的な基礎に関連するような話題。

Disclosures

利害の衝突は宣言されません。

Acknowledgments

我々は編集支援のために氏クレイグD.ラベン（英語学科、ケンタッキー州の大学）に感謝します。ケンタッキー州の大学、生物学科、学部及び芸術科学大学のOfficeでサポート。

Materials

Crayfish (Procambarus clarkii). Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA., USA.
Standard crayfish saline:
- Modified from Van Harreveld's solution (1936). (in mM) 205 NaCl; 5.3 KCl; 13.5 CaCl₂2H₂O; 2.45 MgCl₂6H₂O; 5 HEPES and adjusted to pH 7.4
Dissection tools: Fine #5 tweezers, fine scissors, knife blade holder, #26002-20 insect pins (all obtained from Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139)
Sylgard coated dissection dish, a recording dish either constructed with suction electrode or use a suction electrode and anther manipulator to hold a suction electrode.
Dissecting microscope with zoom function for intracellular recordings. For focal recording on visualized terminals a compound microscope with upright objectives (4 x and 20X) is used. One needs a Hg light source.
Standard intracellular amplifier and A/D board for on line recording to a computer. Electrical signals are recorded on line to a PowerLab/4s interface (ADInstruments, Australia). We use standard software from ADInstruments named Chart or Scope.
Chemicals:
- We use a vital fluorescent dye, 4 [4 (diethylamino) styryl] N methylpyridinium iodide (4 Di 2 Asp; Molecular Probes, Eugene, OR), to visualize the varicosities (Marigassi et al., 1987; Cooper et al., 1995a). All saline chemicals were obtained from Sigma chemical company (St. Louis, MO).
For intracellular recordings we use glass capillary tubing (catalogue # 30-31-0 from FHC, Brunswick, ME, 04011, USA) and for focal macropatch electrodes we use Kimax-51, Kimble Products Art. No. 34502, ID 0.8-1.1mm, length 100mm. The intracellular electrode should have a resistance of 20 to 30 mOhm. The macropatch electrode is constructed by breaking off the tip of the glass after a fine tip was made from an electrode puller. The broken off tip needs to be a clean perpendicular break about 20μM in diameter. The tip is then heat polished to about 10μM inner diameter. The shaft of the electrode is then run over a heating element to cause it to bend about 45 degrees with a gradual bend. This produces a flat or perpendicular electrode lumen over the nerve terminal as the angle with the micro-manipulator will produce about another 45 degrees to the preparation.